第七讲生物碱分析分析分布及注意事项（二）

生物碱分析第七讲

生物碱分布

■含生物碱较多的科有香榧科、榧科、小檗科、獠牙科、罂粟科。山楂科、罂粟科、豆科、马钱科、夹竹桃科、茄科、菊科、百合科和石蒜科、豆科、马钱科、夹竹桃科、茄科、菊科、百合科和石蒜科等。有些科的植物几乎都含有生物碱，如罂粟科。同一科、属或近缘植物中常含有相同或相似的生物碱。曼陀罗属植物曼陀罗、天仙子、东莨菪等植物均含有莨菪碱。

■同一种生物碱也可以分布在不同的科中。例如，小檗碱存在于十字花科、小檗科、Fangsaceae 和芸香科的一些植物中。小檗碱存在于芸香科和芸香科的一些植物中。

■生物碱可以存在于植物的各种器官中。同一种植物往往含有一种以上的生物碱，有的可以含有几种到几十种生物碱。例如，罂粟含有约25种生物碱，长春花含有70多种生物碱。

■生物碱在植物各部位的分布不均，往往集中在某一器官或部位。如乌头（根）、黄连（根茎）、黄柏（树皮）、颠茄（叶）、麻黄（气生茎）、洋地黄（花）、吴茱萸树皮）、颠茄（叶）、麻黄（气生茎）、洋地黄（花）、吴茱萸（果实）、马钱子（种子）等。在同一植物的不同部位，不仅生物碱的含量不同，而且生物碱的种类也可能不同。

特点

■生药中生物碱的含量大多在1%以下，也有少数非常低的。例如，长春花中长春新碱的含量为百万分之一，maydenmus中美登素的含量为千万份。其中之一；有些含量特别高，如黄连中黄连素含量高达9%，金鸡纳皮中奎宁含量高达15%。在植物中，生物碱一般与有机酸（如苹果酸、柠檬酸、酒石酸、单宁酸等）结合形成盐，以溶解状态存在于液泡中，有的与糖结合形成苷。一些生物碱以游离形式存在，例如咖啡因和秋水仙碱。生物碱是生药中一类重要的活性成分。目前已分离出10000余种，其中80余种已用于临床。 （麻黄碱）用于哮喘，萝芙木中的利血平（reserpine）用于降低血压，喜树碱（camptothecine）中的喜树碱（camptothecine）和长春花中的长春新碱（vincristine）用于抗肿瘤等。

分类——根据母核的基本结构分类，有以下12类：

(1)有机胺类(Amines)：氮原子位于直链上，如麻黄碱、益母草、秋水仙碱等；

(2)吡咯烷类：如香豆素、老黄素、百合碱等；

(3)吡啶类：如尼古丁、槟榔碱、半边莲、苦参碱；

(4)喹啉类：如奎宁、喜树碱等；

(5)异喹啉类：如黄连素、吗啡、毒鼠强、石蒜碱、可待因、青藤碱、锡碱等；

(6)喹唑啉酮：如芬宁等；

(7)吲哚类：如利血平、长春新碱、麦角新碱、士的宁；

(8)托烷类：如东莨菪碱、东莨菪碱、可卡因等；

(9)咪唑类：如毛果芸香碱等；

(10)嘌呤类：如咖啡因、茶碱、蘑菇嘌呤等；

(11)类固醇：如茄碱、贝母、藜芦；

(12)萜类：如猕猴桃碱、石斛碱、乌头碱、飞燕草、丁香碱等。

理化性质

1. 特征

生物碱多为结晶固体，少数为液体，如尼古丁、喹啉、槟榔碱等。液体生物碱通常不含氧原子，或分子中的氧原子常形成酯键。一般生物碱是无色的，少数有颜色，如黄连素（黄色）、血根碱（红色）。苦味道。麻黄碱、液体生物碱等少数生物碱具有挥发性，可用蒸汽蒸馏。

2. 旋光活性 大多数生物碱都是左旋的。

3.酸度

一般为季胺碱>叔胺碱>仲胺碱。如果氮原子处于酰胺状态，则碱性很弱甚至消失，如胡椒碱、秋水仙碱等。有些生物碱分子带有酚羟基或羧基，因此是酸碱两性的，如槟榔碱和吗啡。

4.溶解度

游离生物碱极性较小，不溶于水或不溶于水，溶于氯仿、乙醚、苯、丙酮、乙醇等有机溶剂，也溶于稀酸水溶液形成盐类。生物碱盐易溶于水和乙醇，不溶于或不溶于有机溶剂。

5.降水

(1)碘化铋钾试剂

(2)碘-碘化钾试剂

(3)碘化汞钾试剂

(4)硅钨酸试剂

(5)磷钼酸试剂

(6)苦味酸试剂

(7)氯化金试剂

6.显色反应常用的显色试剂如下：

(1)钒酸铵-浓硫酸溶液（曼德林试剂）：它是1%钒酸铵的浓硫酸溶液。该试剂可以与大多数生物碱反应并显示不同的颜色，例如与阿托品, 与士的宁为红色，与士的宁为血红色，与士的宁为紫色，与奎宁为浅橙色，与吗啡为棕色，与可待因为蓝色。

(2)钼酸铵(钠)-浓硫酸溶液(Frobde试剂))：是钼酸铵或钼酸钠的1%浓硫酸溶液。该试剂与可待因呈黄色，与黄连素呈棕绿色，与乌头碱呈黄褐色，与阿托品和士的宁呈无色。使用时要注意，此试剂和蛋白质也会显色。

(3)甲醛浓硫酸试剂（Marquis试剂）：30%甲醛溶液0.2ml和浓硫酸10ml的混合液。此试剂与可待因、吗啡一起显蓝色呈紫红色，与咖啡因无色。

(4)浓硫酸：此试剂加乌头碱呈紫色，加黄连素呈绿色，加阿托品不显色。

(5)浓硝酸：该试剂与黄连素呈棕红色，与秋水仙碱呈蓝色，与乌头碱呈棕红色，与咖啡因呈无色。

化验：

为测定生药中的生物碱含量，应先从植物组织中定量分离，纯化后选择合适的方法测定。

1.生物碱的提取

非极性溶剂极性溶剂混合溶剂

2.生物碱样品的精制

萃取色谱离子对法

3.生物碱定量分析：

■生物碱的定量分析方法大多是根据分子中N原子或双键或官能团的理化性质设计的。

总碱的测定方法

一、权重法

一种非常弱的碱性生物碱或总碱。如元湖中的总生物碱用氨水和氯仿萃取，然后蒸发溶剂，用重量法测定。该方法可分为萃取重量法和沉淀重量法。

1、提取权重法

通常将生物碱提取纯化后，将提取物置于已知重量的容器中，除去溶剂，干燥，称重，即得生物碱或总生物碱的含量。

2、降水重量法

用生物碱沉淀剂沉淀生物碱，然后洗涤，干燥，称重沉淀，计算生物洗涤，干燥，称重沉淀，计算生物碱或总碱的含量。常用的沉淀剂有苦味酸、碱或总碱含量。常用的沉淀剂有苦味酸、硅钨酸、四苯硼钠、瑞德尔铵盐。

二、容量法

1、中和滴定

当被测生物碱偏碱性时，可将提取的单一生物碱或总碱通过适当的方法转化为游离碱，溶解于有机溶剂中，蒸发掉溶剂，残渣中加入过量的标准酸溶液。然后用标准碱倒回，或者不蒸发溶剂，而是加入过量的酸水，将生物碱溶解在酸水中，分离酸液，用水提取有机层，将水提取液和酸提取液合并，用标准碱溶液滴定，或用中性乙醇直接溶解提取的生物碱残渣，再用标准酸直接滴定。

如北斗根片用乙酸乙酯萃取，蒸干，残渣用无水乙醇溶解，碱法测定亮氨酸含量。

2、非水滴定

由于许多生物碱在水溶液中呈弱碱性，中和滴定困难。这种情况下可以考虑非水碱法。

如1995年版《中国药典》中苦参中苦参碱的含量、麻黄中麻黄碱的测定、罂粟壳中生物碱的测定、颠茄中莨菪碱的测定等。以丙酮或醋酸酐-冰醋酸（1:1:5)为溶剂，甲基橙或结晶紫为指示剂，高氯酸标准溶液）滴定小檗胺。

3、雷氏盐法

在酸性溶液中，生物碱可以与雷氏盐即硫氰酸铬铵定量沉淀。过滤收集沉淀，洗涤，溶于丙酮中，用碱性酒石酸钾钠或2M氢氧化钠溶液煮沸。分解，定量释放SCN-，加硝酸酸化，加过量硝酸银标准溶液，以铁钒为指示剂，再用硫氰酸铵溶液滴定剩余的硝酸银，间接测定生物碱的含量。

4、四苯硼钠法

大多数离解常数大于10-11的生物碱阳离子能与四苯硼钠定量形成沉淀，易溶于丙酮或其他有机溶剂。该配合物在水和丙酮或其他有机溶剂中的溶解度很小。因此，生物碱的四苯基硼盐可溶于丙酮，在弱酸中以曙红为指示剂，用硝酸银进行置换滴定。

三、比色法

生物碱能与各种试剂发生显色反应，用有机溶剂萃取后，可进行比色测定。该方法灵敏度高，样品量少，具有一定的特异性和准确性，因此在生物制剂中得到广泛应用。 1、酸性染料比色法

在适当的 pH 介质中，生物碱可以与氢离子结合形成盐。在此条件下，一些酸性染料解离成阴离子，与生物碱的阳离子定量结合，形成有色离子对。该离子可溶于某些有机溶剂浓硫酸 与 小檗碱反应，产生有色溶液，可测定溶液的吸光度，根据比色法计算出有机碱的含量。如硫酸阿托品片、平川Ⅱ中的麻黄碱、止咳糖浆中的麻黄碱，在合适的pH介质中浓硫酸 与 小檗碱反应，与溴百里酚蓝反应，用甲苯或氯仿萃取，在403nm波长处测定阿托品，在422nm处测定阿托品或麻黄碱在 420nm 处测量。

2、雷氏盐比色法

3、复杂比色法

4、海盗比色法

四、紫外分光光度法

对于中药及其制剂中的生物碱，多采用二波长法、三波长法、正交函数法和导数光谱法，以消除许多已知或未知杂质的干扰。例如，生药中的麻黄碱可以作为一种确定阶导数的光谱，胶囊宁愿使用三波长发射等等。

五、薄层色谱-分光光度法

1、比色法

例如，单茶碱在氧化铝薄层板上用氯仿显色，分离后与溴甲酚绿反应形成有色离子对。用氯仿萃取后，进行比色测定。槐豆草含有四种成分：槐碱、苦参碱、槐果碱和槐定碱。在氧化铝薄层板上，用苯-丙酮-乙醇（70:16:1）显影剂），显影后用改进的碘化铋钾试剂显色，刮掉得到的斑点溶于溶剂进行比色测定。

2、紫外分光光度法

龙眼中的胡椒碱是用乙醇提取的。点样在硅胶 G 板上，用苯-乙酸乙酯-丙酮 (7:2:1）) 显色，分离辣椒，在 343nm 处测量。用含甲基的酰胺硅胶 G 测定延胡索中的脱氧富马碱和巴马碱固定相，用氯仿-正丁醇(9:1）)展开，两者分离，用稀硫酸洗脱。脱氢富马林在270nm处测定，巴马汀含量在274nm处测定。 .

3、荧光

止咳喘热肾片中的东莨菪碱和阿托品生物碱用乙醇提取，然后点在板上，氯仿-甲醇-氨（8.5:1.5:<@展开k28@ >07），蒸去溶剂后在荧光灯下观察，东莨菪碱Rf = 0.88，呈亮蓝色荧光，荧光法取E x =330nm，Em = 450nm确定。

指定成分含量的测定

六、薄层色谱法

在薄层色谱上，直接测量活性成分的吸光度或荧光强度，计算出待测成分的含量。与TLC-分光光度法相比，该方法简单、灵敏、稳定，根据检测方法可分为以下三种。

1、比色法

2、紫外分光光度法

3、荧光

七、气相色谱法

衍生化后的注入方式。如USP（XXⅡ）颠茄液体提取物，如：BP（1998)测定硫酸吗啡注射液的含量。如颠茄生物碱中的莨菪碱、东莨菪碱、山莨菪碱使用N-Methyl-3-甲硅烷基乙酰胺甲硅烷基化试剂，衍生得到三甲基甲硅烷基醚衍生物，并采用GC-MS技术进行定量分析。

八、高效液相色谱法

１、反相—高效液相色谱

硅醇基会导致色谱峰拖尾、保留时间过长，甚至在色谱柱上保留时间过长。

(1)向相中加入有机胺或季铵盐

(2)将离子对试剂加入流动相

常见的离子对试剂有：烷基磺酸盐等

(3)调整流动相pH或缓冲液类型和浓度

强碱性生物碱的分离，流动相的pH值应为3.5－5.5。大多数情况下，钾盐缓冲液优于钠盐缓冲液，浓度应在0.01—0.1mol/L之间。

2、离子交换色谱法

对于生物碱的 HPLC 分析，离子交换色谱可以使用与链烷磺酸键合的硅胶作为固定相。

3、正相色谱

例如：测定士的宁和士的宁，以YWG-80为固定相，乙醚-甲醇-氨（80：

20：1） 是流动相，在 250nm 处检测。

九、极谱法

如测定小檗碱的含量，可将小檗碱与四苯硼钠反应，用0.02mol/L Tl2 SO4作为滴定溶液进行示波测定。在硫酸钡存在下，加入磷钼酸试剂沉淀出士的宁和乌头碱，然后用硫酸消解，用极谱法测定残渣中的钼，从而计算生物碱的含量。

十、高性能毛细管电泳 (HPCE)

虽然高效毛细管电泳在定量准确度上略逊于 HPLC，但由于柱效高、分析速度快、节省溶剂和样品，特别适用于中药成分的复杂分析。

例子：苦参

苦参指纹图谱及苦参生物碱在动物体内的药代动力学和代谢研究

一、苦参概述。

化学成分（略）

苦参碱的基本结构：省略

二、LC-MS在苦参指纹图谱建立中的应用

■液相质谱（HPLC-MS）是一种集高效分离、高灵敏度、高选择性检测于一体的现代分离分析方法。 LC-MS技术在中药指纹图谱研究、药材提取方法研究、中药成分归属等实验条件的选择和优化中发挥着重要作用。

其余部分省略。详见课件。