【学者推荐】有机体DNA序列的认识

一、 前言 [1, 2]

基因工程极大地扩展了我们对生物体 DNA 序列的了解。但仍有许多新发现的基因，其功能未知，基因产物如何相互作用以产生活的有机体。功能基因组学试图通过大规模的实验方法来回答这些问题。然而，由于一个基因的表达时间、表达水平、蛋白质翻译后加工和修饰以及它们的亚细胞分布不能仅从DNA序列中得到解答，因此在整体水平上研究蛋白质表达及其功能变得越来越普遍。显得很重要。这些在基因组中无法解决的问题有望在蛋白质组学研究中得到解答。蛋白质组数据与基因组数据的整合将在后基因组研究中发挥重要作用。

目前，蛋白质组研究中使用的主要技术是二维凝胶电泳和质谱。二维凝胶电泳的基本原理是蛋白质首先在pH梯度凝胶中根据其在第一维的等电点进行等电聚焦，然后在第二维通过SDS-PAGE将它们旋转90度进行分离。到它们的分子量。质谱在1990年代取得了长足的进步，生物质谱成为主角，蛋白质组学为生物质谱提供了一个大舞台。其中首选的是MALDI-TOF，分析容量大，单电荷法测定分子量可达30万，干扰因素少，适合蛋白质组的大规模分析。其次，基于ESI的LC-MS在线适合精细研究。本文将介绍几种常用的生物质谱技术，重点介绍生物质谱在蛋白质组学各个领域的应用。

二、生物质谱[3,4]

1.电喷雾质谱 (ESI)[5]

电喷雾电离质谱 (ESI-MS)

在毛细管出口处施加高压，产生的高电场使流出毛细管的液体被雾化成带电的细小液滴。液滴分解成带有一个或多个电荷的大量离子，导致分析物作为单电荷或多电荷离子进入气相。电喷雾电离的特点是产生高电荷离子而不是碎片离子，

质荷比（m/z）降低到大多数质量分析仪可以检测的范围，从而大大扩展了分子量的分析范围。离子的真实分子质量也可以根据质荷比和电荷数来计算。

2.基质辅助激光解吸质谱（MOLDI）[5-7]

基质辅助激光解吸电离 (MOLDI) 是由德国科学家 Karas 和 Hillenkamp 发现的。将微量蛋白质和过量小分子基质的混合液点样在样品靶上，加热或风干形成共晶，放入离子源中。当激光照射在目标上时，基质会吸收激光转变为激发态的能力，从而导致蛋白质的电离和汽化。电离的结果通常是质子从基质转移到蛋白质。然后通过高压将电离的蛋白质从离子源转移到质量分析仪，然后通过离子检测器和数据处理获得质谱图。 TOF 质量分析仪被认为是 MALDI 的最佳匹配，因为两者都以脉冲模式工作，在质量分析过程中离子损失非常少，从而具有高灵敏度。 TOF 质量分析仪结果简单且易于转换。蛋白质离子在飞行管中的飞行速度只与他的(m/z)-1/2成正比，因此通过计算蛋白质离子在飞行管中的飞行时间很容易计算出蛋白质离子。的 m/z 值。与传统质量分析仪相比，更容易获得高分辨率和高测量精度；速度快，离子飞行时间只有几微秒到100微秒左右；质量范围宽，单个几十万道尔顿即可直接检测。带电离子。飞行时间质量分析仪被认为是21世纪最有前途的质量分析仪。

3.傅里叶变换离子回旋共振质谱（FT-ICR MS）[8,9]

傅里叶变换离子回旋共振质谱（FT-ICR）

MS) 是离子回旋共振光谱与现代计算机技术相结合的产物。傅里叶变换离子回旋共振质谱是基于离子在均匀磁场中的回旋运动，

离子的回旋频率、半径、速度和能量是离子质量和离子电荷以及磁场强度的函数。当对离子施加具有相同回旋频率的射频场时，离子同相加速到半径较大的环形交叉路口，

因此，生成了可接受的类电流信号。傅里叶变换-离子回旋共振质谱使用的射频范围覆盖了待测质量范围，所有离子同时被激发，检测到的信号经过傅里叶变换，

转换为质谱。其主要优点是：容易获得高分辨率；易于实现串行极性质谱；易于使用的外部电离源和色谱仪器一起使用。此外，它还具有灵敏度高、质量范围宽、速度快、性能可靠等优点。

4.快原子轰击质谱（FABMS）

快原子轰击质谱法 (FABMS)

它是一种软电离技术，可以用快速惰性原子对存在于基板中的样品进行喷射，从而使样品离子溅射到分析仪中。这种软电离技术适用于高极性、热不稳定的化合物。它特别适用于肽和蛋白质的分析。 FABMS可以提供​​精确的离子质量，从而可以确定样品的元素组成和分子式。和 FABMS

应用

-MS串联技术可以提供更详细的样品分子结构信息，使其在生物医学分析中得到快速发展。

三、蛋白质分析鉴定[3,4,10]

随着质谱技术的发展，分子量的测定已从传统的有机小分子扩展到生物大分子。 MALDI-MS技术因其极高的灵敏度和精密度而被广泛应用于蛋白质分析。该技术不仅可以测定各种疏水性、亲水性和糖蛋白的分子量，还可以直接测定蛋白质混合物的分子量。这可以说是蛋白质分析领域的重大突破。

蛋白质组学是从整体水平研究细胞或生物体内蛋白质的组成和活性。质谱作为蛋白质组研究的三大支撑技术之一，除用于多肽和蛋白质的分子量测定外，还广泛应用于多肽指纹图谱和氨基酸序列测定。

肽质量指纹图谱，

PMF) 测定是一种对蛋白水解或降解后获得的肽混合物进行质谱分析的方法。将质谱分析得到的肽片段与多肽蛋白质数据库中蛋白质的理论肽片段进行比较，以确定检测到的蛋白质是已知的还是未知的。由于不同的蛋白质具有不同的氨基酸序列，因此从不同蛋白质中获得的肽片段具有指纹特征。应用多肽指纹图谱方法对酵母、大肠杆菌、人心肌等蛋白质组进行了研究。

肽序列的测定通常需要应用串联质谱。不同的技术用于选择具有特定质核比的离子，然后进行碰撞诱导解离。通过分析肽段的断裂，推导出肽段序列。

四、转录后修饰蛋白的检测与鉴定

在蛋白质组学研究中，蛋白质和多肽的序列分析不仅限于阐明蛋白质的一级结构，进一步分析翻译后修饰也是蛋白质化学的一项重要任务。这种修饰对蛋白质功能很重要，例如：细胞识别、信号传导和蛋白质定位中的蛋白质相互作用。

1. 蛋白质糖基化[11, 12]

糖蛋白存在于细胞内、细胞膜和细胞外，实际上大多数蛋白质是糖蛋白。糖蛋白的检测和分析表明，糖蛋白中糖组分的结构和功能是多样的。糖蛋白中的糖通常是不同种类的，由数量可控的单糖组成。糖基化的多样性与细胞周期、细胞分化发育的状态有关。在蛋白质组时代，蛋白质的修饰会引起其理化性质的变化，不容忽视。

从 1D 或 2D 凝胶中鉴定糖基化蛋白，通常通过 MALDI-MS 指纹识别，

另外分析通过 MALDI-PAD 或 ESI-MS/MS 获得的碎片光谱。完整糖蛋白的研究非常困难，所有已知的电离技术都有其局限性。目前主要研究糖肽，其中一个好处是质量减少，从而导致更好的分离度，并且糖肽仍保留糖基化位点。可以通过用不同的蛋白酶消化分离的糖蛋白来进行糖肽研究。一旦确定了糖肽，就可以使用串联质谱 (ESI-MS/MS) 来阐明肽序列。当蛋白质的序列已知时，可以通过计算质量差来推断其上连接的寡糖的质量。

为了从糖蛋白中释放糖部分，可以使用化学切割或酶切割（参见图 1) 的流程图）。目前，具有结构特异性糖苷酶的质谱法提供序列、分支和连接数据是最强大的技术。对于N-糖基化，常用的内切糖苷酶是PNGase-F，

PNGase-A，

EndoF 和 EndoH。化学裂解也可用于释放 O-连接和 N-连接多糖，但通常具有完全破坏所有肽键的缺点，从而丢失有关糖附着位点的信息。此外，这些裂解不会从糖肽中连续释放单糖。用肼进行化学切割可以去除两种类型的糖基化。 O-连接糖在 60°C 时特异性释放，而 N-连接糖在 95°C 时释放。一种更常见的释放 O 原子的方法是使用碱基进行 β 消除。通常，金属离子被添加到糖碱中以在 MALDI 和 ESI 中电离。使用 MALDI-MS 分析糖的一个很好的选择是将其与一些其他化合物混合，这可以进一步提高灵敏度和分辨率。不同的质谱方法可以产生源后碎裂（PSD）和碰撞诱导的多糖解离

(CID) 谱，可提供糖序列、分支和糖之间连接的信息。

2. 蛋白质的磷酸化[13, 14]

蛋白质中氨基酸的磷酸化在生命系统中起着重要作用。磷酸化常作为分子开关来控制蛋白质在不同过程中的活性，如代谢、信号转导、细胞分裂等。因此，蛋白质中磷酸氨基酸的鉴定是蛋白质分析中的一项重要工作。已知的磷酸氨基酸有四种：

1.O-磷酸，由丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸等羟基酸磷酸化形成。

2.N-磷酸，由精氨酸、赖氨酸或组氨酸中的氨基磷酸化形成。

3.乙酰磷酸，由天冬氨酸或谷氨酸磷酸化形成。

4.S-磷酸，由半胱氨酸磷酸化形成。

通过质谱分析磷酸化的主要问题是混合物中磷酸化肽的信号被抑制。因此，只有当一些非磷酸化肽的含量降低（或磷酸化肽富集）时，

磷酸化肽的分析变得更容易。已经开发了一些用于质谱分析的预磷酸化肽或磷酸化蛋白质的分离和富集的相应方法和技术。已建立的分离技术包括：双向磷酸肽光谱法（2D-PP）、高效凝胶电泳（2DE）和反相高效液相色谱法（RP-HPLC）。对于32P标记的磷酸化肽或蛋白，可通过放射自显影或储磷屏检测，提取后可通过高灵敏度MALDI-MS进行分析；如果 32P 标记不可行，则必须通过 LC-MS/MS 进行分析，通常是 HPLC 和质谱。使用。

常用的富集方法有： 固定化金属亲和层析 (IMAC)，这是选择性分离和富集磷酸化肽的最广泛的方法。在这种方法中，

与螯合底物结合的金属离子（通常是 Fe3+ 或 Ga3+）在高 pH 条件下选择性地与磷酸化肽中的磷酸盐部分结合

或者可以释放磷酸盐缓冲液中的磷酸化肽。抗体免疫沉淀，高亲和力抗体可以免疫沉淀复杂混合物中的特定蛋白质。目前，使用抗体来富集蛋白质/肽仅限于磷酸化酪氨酸的分析蛋白质组分析，

然后通过 MALDI-TOF MS 分析与抗体连接的磷酸化肽。虽然用于免疫沉淀的抗体必须对其底物具有较高的亲和力，

但低亲和力抗体仍可有效用于蛋白质印迹分析。化学修饰，已经建立了两种从复杂混合物中特异性分离磷酸化蛋白质/肽的方法 [15,16]。然而，这两种方法都需要进一步优化以识别低丰度蛋白质。

磷酸化肽的检测和磷酸化位点的确定主要包括以下质谱技术：MALDI-TOF MS

可以通过肽指纹 (PMF) 识别蛋白质，结合磷酸酶处理可以确定磷酸化位点。原理是经过磷酸酶处理后，磷酸化肽失去磷酸基团，产生特定的质量变化，MALDI-TOF

MS 通过检测这种质量变化来确定磷酸化位点。串联质谱（MS/MS）

提供前体离子扫描，通过检测磷酸基团产生的特定片段来报告磷酸肽的存在。磷酸化肽经过 CID 生成磷酸基团的特定片段，在通过串联质谱法进行前体离子扫描期间，这些片段可用作磷酸肽的“报告离子”。串联质谱还可以进行中性丢失扫描，即用MS/MS检测CID后中性丢失的H3PO4。

(98 u) 肽。此外，LC-MS/MS 也被用于分析磷酸化位点，因为肽的 LC 分离降低了离子抑制效应。傅里叶变换质谱法的电子捕获解离

电子捕获解离 (ECD) 与傅里叶变换离子回旋共振 (FTICR) 质谱联用是一种强大的蛋白质和肽测序以及蛋白质翻译后修饰研究的方法。最近，它已成功用于鉴定肽片段上的磷酸化残基。

五、总结

目前，生物质谱被认为是大规模、高通量蛋白质结构鉴定的首选工具，但与之结合的二维电泳仍存在工作量大、重现性差等缺点。因此，它会得到改进，比如分子扫描技术。由于蛋白质混合物可以通过LC-MS/MS直接鉴定，预计未来不会通过二维

可以研究蛋白质组。当然，还有一些技术问题需要解决，其中最根本的就是质谱的定量问题。生物质谱的魅力在于它可以帮助我们研究蛋白质-

蛋白质相互作用、翻译后修饰甚至基因表达水平的变化。相信随着生物质谱技术和数据采集软件技术的飞速发展，我们将能够获得更多这方面的信息，从而揭开生命的奥秘。

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蛋白质组学

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