美国明尼苏达州梅奥诊所检验医学和病理学系研究手段：基于DIA的蛋白质组学

出版者：美国明尼苏达州梅奥诊所检验医学和病理学系

研究工具：基于DIA的蛋白质组学

一、研究背景

SARS-CoV-2 是 COVID-19 的病原体，对人类健康构成巨大威胁。感染 SARS-CoV-2 通常会引起轻微症状，但在某些患者中会出现过度的炎症免疫反应，从而导致严重的后果，例如急性呼吸窘迫综合征。SARS-CoV-2通过其S蛋白与宿主细胞表面的血管紧张素转化酶2（ACE2)）结合，进入呼吸道，然后被丝氨酸蛋白酶（TMPRSS2) . 鼻咽部是 SARS-CoV-2)。- CoV-2暴露的主要部位，鼻咽的宿主蛋白质组学研究有助于了解发病机制并找到药物靶点的线索。在包括鼻咽粘膜在内的上部组织上使用鼻咽拭子（NP 拭子）对呼吸道进行取样，这是用于 COVID-19 诊断测试的标准采样。虽然已经有使用 NP 拭子检测病毒的质谱研究，但对 NP 拭子的宿主蛋白质组学分析却落后。

二、研究路线

图 1 基于 DIA 的蛋白质组分析的总体工作流程。使用 diaPASEF 模式在 timsTOF Pro 质谱仪上处理和分析鼻咽拭子样本。PASEF-DDA 数据是从合并的样本中获得的，组织到库中并进行分析。

三、研究结果

1. 整合定量蛋白质组学

DDA 方法的一个主要缺点是缺乏可重复的测量，这主要是由于 MS/MS 分析期间母离子采样的随机性。相比之下，DIA 方法确保所有前体离子在任何预定的隔离窗口内都被碎片化，从而显着提高了蛋白质组学检测的重现性。作者设计了支持 PASEF 模式与 DIA 耦合的质谱研究，通过注射培养的 Jurkat 细胞的肽消化物来评估 DDA 和在 PASEF 模式下运行的 DIA 的性能，然后分析获得的 PASEF-DDA 数据。从三个 DDA 重复实验中鉴定出 4747 种蛋白质，在重复中检测到 2721 种蛋白质（57%），相比之下，在三个 DIA 实验中的每一个中鉴定出相同的 4490 种（94%）蛋白质（图 2A）。

图2（A）PASEF-DDA和diaPASEF三个实验中蛋白质组数条形图；(B) PASEF-DDA 和 diaPASEF 的三个实验中蛋白质丰度的相关性。

2.使用PASEF-DDA生成鼻咽综合蛋白目录

从分级样本的PASEF-DDA数据中，实验共鉴定出102392条肽段，对应7723个蛋白质组，将其整理成谱库，然后与以往的鼻咽蛋白质组学研究进行比较蛋白质组分析，评价谱库的综合性。（图 3A）。结果表明，本研究涵盖了以往研究中检测到的大部分分子，此外还发现了以往研究遗漏的 5110 个基因，证实了本研究提供了迄今为止最广泛的 NP 拭子收集的鼻咽蛋白。目录。细胞亚型分析（图 3B）证实鼻咽拭子样本含有免疫细胞和上皮细胞的异质混合物，并且免疫细胞亚型（包括 B 淋巴母细胞和 NK 细胞）富含免疫细胞特异性标志物，如 CD2、CD14、CD38 和颗粒酶 B、上皮和上皮特异性标志物，包括 CDH1 和 CLDN3 . 从图 3C 可以看出，母离子的质量范围为 300 至 1700 m/z，离子淌度范围为 0.6 至 1.6 V s cm–2。接下来通过基​​于强度的绝对量化（iBAQ）值评估蛋白质组学的深度（图 3D）。在 neXtProt 数据库中搜索相同的数据确定了 7243 个蛋白质组及其 iBAQ 值，蛋白质丰度跨越 6 个数量级的动态范围，表达最少的蛋白质是淋巴细胞抗原 75（LY75)，而最丰富的蛋白质是免疫球蛋白κ恒定链（IGKC）。

该研究进一步将鉴定出的蛋白质与 neXtProt 数据库中的“缺失蛋白质”列表相匹配。值得注意的是，5个已鉴定的蛋白（GOLGA8F、CROCC2、HSP90AA4P、PMS2P11和WDR49）被标记为缺失蛋白。其中，WDR49属于蛋白PE2（仅在转录水平有证据））类别，而其余​​四种蛋白质属于 PE5（不确定或可疑）类别。可以从图 3E 中蛋白质 CROCC2 和肽 LEDTILSPTASR 的 MS/MS 光谱和动态光谱中获得进一步的验证。

图 3 鼻咽蛋白质组目录的生成。(A) 鼻咽蛋白质组与之前对 NP 拭子样本的蛋白质组学研究的比较。(B) PASEF-DDA 实验中细胞蛋白亚型的鉴定。(C) 库中包含的 102,392 个肽的前体质量密度分布和离子迁移率。(D) 已鉴定蛋白质的 iBAQ 强度分布。鼻咽中表达的蛋白质用黑色标记，缺失的蛋白质用红色标记。(E) 缺失蛋白 CROCC2 的实验和合成肽 LEDTILSPTASR 的 MS/MS 光谱和动力学。

3.单个鼻咽拭子的定量 diaPASEF 分析

通过使用 25 m/z 的隔离窗口以 diaPASEF 模式注射相同量的肽（即 1 μg），对单个 SARS-CoV-2 阳性和阴性 NP 拭子样本进行蛋白质组的无偏测量。从图4A可以看出，本次实验共检测到79703个肽段，对应5023个蛋白质组，平均每个样本检测到3387个蛋白质组。在 SARS-CoV-2 阳性样本中鉴定的 4943 种蛋白质中，577 种上调，46 种下调（|fold-change|>2 和调整的 p 值

通过独创性途径分析（IPA）根据其功能和亚细胞定位对差异蛋白进行分类（图4C）。分析表明，差异蛋白是来自不同细胞区室（主要是细胞质）的 141 种酶、46 种转录调节因子和 40 种激酶。许多激酶在阳性样品中上调，包括 TBK1、CMPK2 和 TAOK3。图 4D 显示了 DAVID 基于基因本体论的对上调蛋白质的生物过程的富集分析。分析表明，与病毒感染的先天免疫反应相关的蛋白质显着富集，包括 I 型 IFN 和 IFN-γ 介导的信号通路，尽管富集在 FDR>0.1 时不显着，但有几种蛋白质（SERPINB10、BNIP3L、BCL2L1 和 HMGA<

图 4 diaPASEF 的定量分析。(A) 使用 diaPASEF 对 45 个 SARS-CoV-2 阳性和 45 个阴性样本进行实验分析获得的蛋白质量的条形图。(B) 火山图描绘了阳性和阴性样本之间蛋白质表达的变化。(C) 条形图显示差异表达蛋白质的分子类型和亚细胞定位。(D) 上调蛋白质的基因本体分析。根据 DAVID 的错误发现率 (FDR)

4. 先天免疫反应和病毒复制的特征

先天性 IFN 反应途径是抵御病毒感染的第一道防线之一。如图 5A 所示，病毒识别触发 caspase 激活和募集结构域 (CARD) 与线粒体抗病毒衔接蛋白 (MAVS) 的相互作用，进而启动下游信号以激活核因子 kB (NF-κB) 和 TANK-结合激酶 1 (TBK1)，这些蛋白质磷酸化干扰素调节因子 3 (IRF-3))，导致核转位和 I 型干扰素 (IFN-I) 的表达。分泌的 IFN-I 激活 Janus激酶 1（JAK1) 和酪氨酸激酶 2（TYK2)，磷酸化信号传感器和转录激活因子 (STAT1/2))。磷酸化 STAT1 和 STAT2 形成异二聚体。聚集，结合干扰素调节因子 9 (IRF9) 为了形成 ISGF3，ISGF3 进入细胞核并表达数百个 ISG。作者根据其功能对鉴定的 ISG 进行了进一步分类蛋白质组分析，研究中鉴定的蛋白质与 628 个先前表征的 ISG 相匹配（图 5B）。该研究发现在特征 ISG 列表中鉴定出 65 种蛋白质，其中 35 种 ISG 被归类为 IFN 介质/抗病毒效应物。此外，PARP9、 PARP12 和 PARP14 也在 35 种 IFN 介质/抗病毒效应子中。其中 35 个 ISG 被归类为 IFN 介质/抗病毒效应子。此外，PARP9、 PARP12 和 PARP14 也在 35 种 IFN 介质/抗病毒效应子中。其中 35 个 ISG 被归类为 IFN 介质/抗病毒效应子。此外，PARP9、 PARP12 和 PARP14 也在 35 种 IFN 介质/抗病毒效应子中。

除了抗病毒免疫反应，图 4D 的功能富集分析揭示了与病毒复制相关的其他生物学过程，例如由胞吐作用介导的从内质网 (ER) 到高尔基体囊泡的囊泡对接。运输。SARS-CoV-2 遵循病毒感染的一般机制——将 RNA 输送到细胞中，在那里复制并随后从细胞中释放出来。在这种情况下，胞吐作用途径预计在 SARS-CoV-2 阳性受试者中占主导地位。作者发现七种上调蛋白（VPS18/45、STXBP1、PLEK、EXOC4、RAB8B 和 SYTL2) 与胞吐作用中的囊泡对接过程相关。同样，ER 到高尔基体囊泡介导的高尔基体组织过程的转运和表达也发生了改变，

由于大多数已鉴定的 ER 或高尔基体相关蛋白尚未在 SARS-CoV-2 研究中报告，因此作者为每个过程构建了蛋白质-蛋白质相互作用 (PPI) 网络（图 5C）以分析发挥作用的分子每个过程中的关键作用。蛋白质 LMAN1、COG8 和 FOLR1 被证明是 ER/Golgi 相关过程中更高相互作用的分子。LMAN1，也称为 ERGIC53，是一种参与早期胞吐作用中糖蛋白转运的货物受体，LMAN1 对病毒生命周期至关重要，它的缺失会产生非感染性病毒颗粒。COG8 是一种寡聚高尔基体 (COG) 复合物，参与细胞内膜运输。

将差异蛋白与报道的 SARS-CoV-2 相互作用组进行比较，以进一步评估差异蛋白是否与病毒蛋白相互作用。图 5D 显示，已确认 24 种上调蛋白与 SARS-CoV-2 相互作用。其中，MRPS27、NUP54/214、BRD2/4、RIPK1、NUP98和DNMT1——抑制这些蛋白的药物已获批生产，可基于SARS- 用于进一步研究的 CoV-2 感染模型系统。这是第一次证明这些蛋白质在 SARS-CoV-2 感染的临床样本中以升高的水平表达，需要进一步的功能分析来确定它们是任何治疗策略的潜在目标。

图 5 SARS-CoV-2 阳性受试者中上调蛋白的功能分析。(A) 阳性样本中升高的代表性典型途径。描述了 RIG-I 样受体 (RLR) 和 Toll 样受体 (TLR) 介导的 IFN-α/β 产生和下游干扰素信号传导。显示了所选蛋白质的箱线图。(B) 90 个样本中 64 个 ISG 的热图，根据它们在 RNA 过程、IFN 调节剂-抗病毒效应子、炎症和代谢调节中的功能进行分类。(C) 与高尔基体组织、ER 到高尔基体囊泡介导的转运和胞吐作用相关的分子的蛋白质-蛋白质相互作用。显示了蛋白质 COG8、FOLR1、LMAN1 的箱线图。(D) 已知与 SARS-CoV-2 相互作用的上调蛋白质。

四、结论

该研究表明，使用 diaPASEF 方法对临床样本进行全面蛋白质组学分析可以帮助破译宿主对 SARS-CoV-2 感染的反应。数据揭示了 SARS-CoV-2 阳性受试者的几个生物学过程的激活，包括先天免疫反应（IFN 信号通路）和病毒复制（胞吐作用和 ER/高尔基体转运）。

文章链接：

参考：

(1) Gallo, O.; Locatello, LG; Mazzoni, A.; Novelli, L.; Annunziato, F. 鼻微环境在 SARS-CoV-的传播、调节和临床进展中的核心作用2 感染. 黏膜免疫学. 2021, 14 (2), 305−316.

(2) Hewitt, RJ; Lloyd, CM 通过气道上皮细胞景观调节免疫反应。Nat. Rev. Immunol. 2021, 21 (6), 347−362.

(3) Hoffmann, M.; Kleine-Weber, H.; Schroeder, S.; Kruger, N.; Herrler, T.; Erichsen, S.; Schiergens, TS; Herrler, G.; Wu, NH ；Nitsche, A.；Muller, MA；Drosten, C.；Pohlmann, S. SARS-CoV-2 细胞进入取决于 ACE2 和 TMPRSS2，并被临床证明的蛋白酶抑制剂阻断。Cell 2020, 181 (2)@ >, 271−280.

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