摘要视网膜色素上皮的全面分析揭示了对炎症刺激的多种途径改变

对视网膜色素上皮的全面蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学分析揭示了炎症刺激反应的多种通路改变

对视网膜色素上皮的全面蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学分析揭示了炎症刺激的多种途径改变

期刊：Int J Mol Sci (IF = 4.556)

出版者：首尔国立大学

导读

RNAsesq、蛋白质组学和磷组学等组学分析文章非常常见，但大多数影响因子较低。为什么，让我们看看这篇文章是如何做到的。

总结

视网膜色素上皮 (RPE) 的持续性炎症会导致视网膜环境发生破坏性变化，但确切的机制仍不清楚。在这项研究中，我们旨在研究 RPE 对强烈炎症的特异性生物和代谢反应，并确定决定病理进展的分子特征。使用最新的等压串联质谱标签 (TMT) 标记方法，在脂多糖 (LPS) 处理 45 分钟至 24 小时后，对人 RPE 细胞系 ARPE-19 的蛋白质组和磷酸化蛋白质组进行了定量分析。共鉴定出 8984 种蛋白质蛋白质组分析，其中 261 种蛋白质在 LPS 处理 24 小时后丰度变化 1.5 倍。磷酸化蛋白质组分析从具有 3,103 个磷酸化位点的 3,207 种磷酸蛋白中鉴定出 20,632 种独特的磷酸肽。结合蛋白质组学和磷酸蛋白质组学分析显示，与线粒体呼吸和细胞周期检查点相关的蛋白质在 LPS 刺激后显着下调，而与脂质代谢、氨基酸代谢、细胞基质粘附和内质网相关的蛋白质显着下调。 (ER) 压力相关的蛋白质上调。此外，已确定包括 MAPKK 和 Wnt/β-连环蛋白信号在内的多种途径的磷酸化事件与 LPS 触发的病理生物学有关。从本质上讲，本研究的结果揭示了 RPE 在炎症下发挥的多种综合信号，并有望为 RPE 疾病治疗干预的发展提供见解。

前言

视网膜色素上皮 (RPE) 是位于视网膜和脉络膜之间的六角形色素细胞层。许多研究指出，由复杂的生物疾病引起的持续性炎症会刺激免疫细胞的募集和激活，加剧新陈代谢，导致 RPE 发生病理生物学变化。然而，导致 RPE 发生这些破坏性变化的确切机制尚不清楚，有必要进一步了解决定疾病进展的 RPE 特异性炎症反应。

高灵敏度串联质谱 (TMT) 标记方法与高分辨率质谱相结合是最近开发的蛋白质组学技术，可以识别数千种蛋白质，覆盖范围和准确性更高。本研究试图阐明脂多糖（LPS）诱导的炎症细胞中蛋白质组和磷酸化蛋白质组的差异表达模式，并确定异常通路如何诱导RPE变性表型。

方法

用不同浓度的脂多糖 (LPS) 刺激 ARPE-19 细胞指定的时间（45 分钟和 24 小时；n = 3） 用于下游蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学分析。

使用 Perseus 软件对蛋白质组数据进行统计分析。 t 检验用于识别蛋白质表达的统计学显着差异，以及分析磷酸化蛋白质组数据集的磷酸化水平的统计学显着差异。对于层次聚类分析，使用单向方差分析进行多样本测试。使用 Cytoscape 工具 ClueGO 插件实施基因本体 (GO) 注释和通路富集分析。基因集富集分析 (GSEA) 分析蛋白质定量数据并在密度图中显示相对于整个数据集的基因集丰度。使用STRING数据库对差异蛋白质组和磷酸化蛋白质组中的蛋白质相互作用进行网络分析。

更详细的材料和方法可以在在线补充材料中找到。

结果

为了确定可引发 RPE 代谢和促炎反应的脂多糖 (LPS) 浓度，使用不同浓度的 LPS 评估了细胞外酸化率 (ECAR)/耗氧率 (OCR) 和炎性细胞因子水平，炎症驱动的病理进展已在 24 小时内开始。在 LPS 处理后 30 分钟到 1 小时之间显示出显着的代谢变化，这意味着在这两个时间点之间已经开始了一个重要的信号级联反应。

根据细胞动力学评估，作者将 45 分钟用于早期信号事件，24 小时用于晚期蛋白质组变化。

图 1，研究脂多糖 (LPS) 刺激的 ARPE-19 蛋白质组和磷酸化蛋白质组的工作流程。 (A) 极化 ARPE-19 细胞的免疫荧光图像，显示 ZO-1（红色）和 RPE65（绿色）或 Na+K+ ATPase（绿色）； (B,C) 实时测量细胞外酸化率 (ECAR) 和耗氧率 (OCR)，以评估 ARPE-19 细胞对不同浓度 LPS 的代谢反应； (D) LPS处理的ARPE-19细胞过程的基于串联质谱(TMT)的蛋白质组学/磷酸化方法。

随后是蛋白质组和磷酸化蛋白质组的总体概述，包括已鉴定蛋白质的数量、差异蛋白质的数量等。

相关性分析或主成分分析 (PCA) 均显示出良好的生物复制性以及组间差异。在8,984个蛋白质中鉴定出130,878个独特肽段，平均序列覆盖率为31%，261个蛋白质有差异表达。从 3207 个具有 3103 个磷酸化位点的磷蛋白中鉴定出 20632 个独特的磷酸肽，并发现 2561 个蛋白质在蛋白质和磷酸化蛋白质之间重叠。大多数磷蛋白在早期或晚期都没有受到 LPS 刺激的显着影响，因为平均 log2 倍变化以零为中心。

图 2，LPS 刺激的 ARPE-19 蛋白质组和磷酸化蛋白质组概述。 (A) 蛋白质组和磷酸化蛋白质组的主成分分析 (PCA)； （B，C）蛋白质组和磷酸化蛋白质组概况； (D) 蛋白质组和磷酸蛋白质组鉴定的蛋白质重叠； (E) 对倍数变化分布的直方图； (F) 用于差异表达分析的火山图。

为了研究与炎症驱动的病理学相关的生物学过程，进行了层次聚类和基因本体论 (GO) 富集分析。 45分钟差异蛋白数量较少，通路富集不明显。在 24 小时对 4192 种差异表达蛋白质的 GO 分析显示，与线粒体代谢和细胞周期检查点相关的蛋白质下调、脂质和氨基酸代谢的扰动以及细胞-基质粘附、内质网 (ER) 应激和外在凋亡信号传导上调。

为了获得与差异表达模式相关的功能性蛋白质谱，还使用了基因集富集分析 (GSEA)。在主要的代谢扰动中，研究中的 153 种上调和下调蛋白质调节两个重要途径，即白细胞稳态和细胞-基质粘附。在 RPE 中，高迁移率组框 1（HMGB1） 和缺氧诱导因子 1α（HIF1α）在 RPE 中充当促血管生成和促炎因子，在炎症过程中大量增加。细胞内粘附分子 1 （ICAM-1）、纤连蛋白 1（FN1）、fibrin-1（FBN1） 和血小板反应蛋白 1（THBS1） 与细胞粘附有关）），尤其是上调基质金属肽酶 14 (MMP14），一种维持布鲁赫膜 (BrM) 的结构元件，连接性粘附分子 3 (JAM3）) 的合成被强烈下调 关键酶在调节 N-Cadherin 和 ZO-1 募集形成紧密连接的 N-Cadherin 和 ZO-1 之间的生理平衡中，炎症也会降低。（列出一些起重要作用的蛋白质或途径，简要描述函数和表达式的变化关系）

图 3，差异蛋白的功能分析。 (A) LPS 处理 24 小时后差异表达蛋白质的分层聚类并显示其丰富的术语； (B) GSEA 的高贡献蛋白热图。

为了进一步研究受蛋白质磷酸化和去磷酸化调节的 LPS 诱导的信号通路，聚类分析揭示了磷酸化进程的三种不同模式。簇 1 的差异磷酸化肽富含胆固醇代谢、细胞衰老、细胞-基质粘附和细胞死亡过程。第 2 组包括蛋白激酶活性、细胞对 DNA 损伤的反应和对细胞因子的反应。 Cluster 3 参与 p38 MAPK 级联和 β-catenin-TCF 复合物组装。

并列出一些参与重要途径的蛋白质，并简要描述关键蛋白质成分的磷酸化状态。参与 NF-κB 活化的蛋白激酶 Cδ (PRKCD) 在 Ser-304 残基处被磷酸化。 β-连环蛋白 (CTNNB1） 通过与 NF-κB 的串扰参与炎症调节，并在 Ser-552 残基处被磷酸化。已知 occludin (OCLN) 的磷酸化发生在维持紧密连接的完整性中，已确定在 Ser-321 残基处显着去磷酸化。

图 4，磷酸化蛋白的功能分析。 (A) LPS 处理 45 分钟和 24 小时后，磷酸盐的层次聚类显着改变，术语显示其富集； (B) 41个磷酸化位点的磷酸化状态在三个时间点发生显着变化。

构建了蛋白质-蛋白质相互作用 (PPI) 网络，以整合有关蛋白质丰度、激活状态和分子相互作用的信息，以识别蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学在炎症驱动的发病机制相互作用中的复杂性。我们专注于基于 GSEA 和 GO 富集选择的 106 种关键差异蛋白和 30 种差异磷蛋白。该网络包含136个节点和1094条边，表明它们是多功能且相互依赖的，并丰富了与RPE病理生物学密切相关的16个GO生物过程术语。

图 5，ARPE-19 细胞中与炎症驱动的病理学相关的蛋白质的网络分析；圆圈表示差异蛋白，菱形表示差异磷蛋白。

讨论

本研究中的蛋白质组学和磷蛋白定量为视网膜色素上皮 (RPE) 中炎症驱动的生物和代谢变化提供了一个全球概览。在脂多糖 (LPS) 诱导的炎症的 ARPE-19 细胞中共鉴定出 4490 种差异表达蛋白和 1561 种差异磷酸化蛋白。发现与线粒体呼吸、细胞周期检查点和抗氧化系统相关的蛋白质显着下调，被认为与脂质代谢、氨基酸代谢、内质网应激、细胞-基质相互作用和细胞凋亡的强烈扰动有关。发现与 MAPKK 通路、Wnt/β-catenin 通路和 I-κB/NF-κB 信号通路相关的早期磷酸化事件，以及随后与细胞衰老和细胞-基质粘附相关的蛋白质的磷酸化/去磷酸化与发病机制有关。

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点评：本文使用3个时间点做蛋白质组学和磷组学研究，不涉及其他实验。数据分析只是描述测序数据，差异蛋白，蛋白和位点稍微扩展，进行常规的GO/KEGG分析。这是一个典型的组学分析思路。

缺点：

1）只讨论你自己的数据。如果和以往的研究比较，可以比较相似模型的RNAseq数据，蛋白质，代谢，甚至重要的突变基因等，找出数据的相关性。通过揭示相同点和不同点，文章的价值将大大增加。

2）缺乏机制关联，这里只关联通路，没有深入到通路，揭示蛋白质和底物的关系等。如果能找到一两个核心通路或机制（来源文献），梳理激酶与底物的关系，总结哪些激酶是磷酸化变化的结果，以及这种变化可能引起的信号轴变化，提出信号轴。这篇文章的价值会大大提升。

3）蛋白质谱和磷酸化之间的相关性较小。这里提到了两点蛋白质组分析，应该主要讨论一下，两者是如何一起发挥作用的，有没有一种蛋白质没有发生变化，而磷酸化发生了变化。蛋白质。是否可以讨论，总之有很多地方可以分析讨论....

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另外，如果老师或学生对RNAseq（mRNA、lncRNA、miRNA、circRNA）或蛋白质组数据分析和作图有任何疑问，欢迎来电咨询。

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