分子对接结果显示金丝桃苷与新型冠状病毒3CL（SARS-19）的作用机制

摘要：目的通过网络药理学和分子对接技术探讨金银花入血干预新型冠状病毒肺炎（COVID-19）的作用机制。方法：通过Swiss Target Prediction and Similarity Ensemble Approach数据库检索血液中金银花的靶基因，使用GeneCards数据库和CTD数据库检索COVID-19靶基因，并使用Cytoscape构建3. 7.1 个软件。金银花成分进入血靶网络，利用DAVID工具对金银花抗COVID-19靶基因进行GO生物过程富集分析，利用KOBAS3.0工具对金银花进行KEGG通路富集分析抗 COVID-19 靶基因组分析。结果筛选出金银花10种血液成分：金丝桃素、7-甲氧基香豆素、3-O-阿魏酰奎尼酸、绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸、对苯二甲酸二甲酯。酯、癸二酸二丁酯、十六碳烯酸、herboxidiene，可能通过作用于磷酸肌醇 3 激酶调节亚基 1 (PIK3R1)、B 细胞 kappa 轻肽基因增强子核因子 1 (NFKB1)、鼠肉瘤病毒癌基因 (HRAS)、白细胞介素 6 (IL6 ), 肿瘤坏死因子 (TNF), 肿瘤蛋白 p53 (TP53), caspase 3 (CASP3), 生长因子受体结合蛋白 2 (GRB2), 糖前合酶激酶 3β (GSK3β), 禽肉瘤病毒的推定转化基因 17 （JUN）、丝裂原活化蛋白激酶10（MAPK10）、丝裂原活化蛋白激酶14（MAPK14）、丝裂原活化蛋白激酶8（MAPK8）等关键靶点干预27条关键信号通路，主要涉及免疫、炎症、病毒、神经系统和其他相关途径。分子对接结果表明，金丝桃苷与新型冠状病毒 3CL (SARS-CoV-2 3CL) 水解酶和血管紧张素转换酶 2 (ACE2) 结合最为稳定。结论 金银花血液成分通过干扰抗炎、抗病毒、免疫、解热、镇痛、镇静等相关蛋白及通路发挥抗COVID-19作用。

新型冠状病毒肺炎（COVID-19）是由新型冠状病毒（SARS-CoV-2）感染引起的急性呼吸道传染病，属于中医药范畴[1]。中医辨证论治以毒、痰、湿、虚、肺为主，兼顾脾胃、化痰、止咳平喘、益气利湿。国家和各省（区、市）公布的COVID-19中医药诊疗方案涉及241种中成药。华清瘟胶囊、痰热清注射液等均含有金银花、黄芩等[1]。 10个治疗严重急性呼吸综合征（SARS）和COVID-19的高频中药化合物与血管紧张素转换酶II（ACE2））进行分子对接，得分较高的化合物属于最多中药。金银花、连翘、甘草[3]。

金银花是 Lonicera japonica Thunb 的第一朵开花或干燥的花蕾。萜类和环烯醚萜类等具有抗炎、抗病毒、抗氧化和保肝作用[4]。研究表明，金银花具有抗登革热病毒（DENV2）、甲型流感病毒（FM1）、乙型肝炎病毒（HBV）等作用[5-7]。金银花在《国家新中成药》（第二版）中清热解毒用药频次排名第三。在防控COVID-19疫情中发挥了重要作用[2]，可作为预防COVID-19的日常食用中药材。

中药血清药物化学主要研究体内吸收药物的种类和代谢等，对中药的药效物质进行快速准确的分析鉴定[9]。本课题组前期，基于血清药物化学理论，采用UPLCQ-TOF-MS技术对ig金银花后大鼠血液中的过渡成分进行分析，并进行共鉴定。鉴定出12种血液成分，鉴定出6种原型成分和6种代谢物成分[10]。研究表明，分子对接技术用于研究清肺排毒汤的血液成分，12种血液成分作用于55名COVID-19患者。其中，黄芩苷、甘草酸、橙皮苷和金丝桃素是清肺排毒汤发挥作用的关键成分[11-13]。因此，本研究采用网络药理学和分子对接技术，探索金银花输血成分干预COVID-19的作用机制，为通过饮食预防COVID-19提供参考。

1材料和方法

1.1采集金银花靶点和疾病靶点的输血成分

利用ALOGPS2.1(alogps/)平台，将金银花血中的过渡成分结构图转换为标准的Canonical SMILES格式，并输入到SwissTargetPrediction平台和Similarity the ensemble approach (SEA ) 数据库用于预测血液成分的目标。使用GeneCards数据库和CTD数据库搜索“COVID-19”、“新型冠状病毒肺炎”、“新型冠状病毒2019”等，筛选和删除重复的靶基因。

1.2构建组件-目标网络图和蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络图

用COVID-19将金银花链接到血液成分靶点进行交叉对齐以获得血液进入成分-疾病靶点，并使用Cytoscape 3.7.1软件构建成分-靶点网络。为了分析target之间的交互，将候选target导入String数据库，获取target之间的交互关系，保存为TSV格式，将entry node1和node2的数据导入Cytoscape 3.@ >7.1 软件计算度数，分析网络拓扑参数，筛选关键蛋白靶点，使用MCODE插件进行Cluster模块分析。

1.3 功能富集分析和通路富集分析与构建组件-靶点-通路网络图

使用 DAVID 工具 ( ) 对金银花抗 COVID-19 靶基因进行基因本体 (GO) 生物过程富集分析 P <0.05 途径。使用KOBAS3.0 ( / ) 工具对金银花的抗COVID-19靶基因进行京都基因和基因组百科全书(KEGG)通路富集分析。 19 利用Cytoscape3.7.1软件构建了靶基因可能的生物学功能及相关通路，构建了组分-靶-通路网络图。

1.4 分子对接实验

从 PDB 数据库中下载 COVID-19 水解酶和血管紧张素转换酶 II (ACE2) 的 3D 结构式，并使用 pymol 软件进行移动。去除配体和非蛋白质分子，通过PubChem平台查询和下载金银花血液成分核心配体结构的mol2格式。将它们导入SwissDock对接软件，即可获得两者的结合能（ΔG）。 ΔG越低越稳定，可视化使用UCSFchimera软件。

2结果与分析

2.1金银花血液成分鉴定

本课题组基于血清药物化学理论鸟苷酸环化酶 信号通路，采用UPLCQ-TOF-MS技术对大鼠ig金银花血液中的过渡成分进行分析[10]，共鉴定出12种血液成分。具体信息见表1，鉴定出6种原型成分和6种代谢成分。它是7-甲氧基香豆素(7-methoxycoumarin)、3-O-阿魏酰奎尼酸(3-O-feruloylquinicacid)、金丝桃苷(hyperoside)、绿原酸(chlorogenicacid)、新绿原酸(neochlorogenic acid)、隐绿原酸(cryptochlorogenic acid)，代谢成分是对苯二甲酸二甲酯（对苯二甲酸二甲酯）、癸二酸二丁酯（癸二酸二丁酯）、十六碳烯酸（hexadecenoic acid）、herboxidiene、2-propenoicacid、2-methy1-、与 2-乙基己基 2-丙烯酸和甲基 2-甲基-2 的聚合物-丙烯酸酯，3-{(1 S ,2 S ,6 S )-6-isopropeny-1,3-dimethyl -

[(S)-3-甲基-5-(2 R ,3 R ,4 S ,5 S )-3,4,5-三羟基-四氢-吡喃-2-基氧基)-戊基]-环己基- 3-烯基}-丙酸。

2.2金银花入血成分靶点及疾病靶点筛选

使用ALOGPS 2.@ >1平台将金银花融入血液成分 7-甲氧基香豆素、3-O-阿魏酰奎尼酸、金丝桃素、绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸、对苯二甲酸二甲酯酯、癸二酸二丁酯、十六碳烯酸的结构图酸，herboxidiene 被转换为标准的 Canonical SMILES 格式。将Canonical SMILES格式文件导入Swiss Target Prediction平台和Similarity Ensemble Approach (SEA)数据库，并将其属性设置为“homosapiens”，以预测金银花进入血液的潜在目标。瑞士目标预测数据库用于筛选 226 个目标，SEA 数据库用于筛选 339 个目标。删除重复项共获得549个目标。从 GeneCards 数据库检索到 262 个 COVID-19 相关靶点，从 CTD 数据库检索到 12 671 个靶点，从 GeneCards 和 CTD 数据库检索到 12 704 个靶点。

2.3 组件-目标网络图

将金银花的功能映射到血液成分和 COVID-19 的相应靶点，筛选出 266 株金银花干预 COVID-19 的潜在靶点。构建了金银花进入血液成分-靶点网络，如图1所示，其中隐绿原酸作用于42个靶点，新绿原酸作用于38个靶点，绿原酸作用于37个靶点。从靶点来看，比较重要的靶点是碳酸酐酶2（CA2）、碳酸酐酶12（CA12）、碳酸酐酶1（CA1）、碳酸酐酶1）） . 脱水酶 9 (CA9）, 基质金属蛋白酶 2 (MMP2）, 盒式转运蛋白亚家族 G2 (ABCG2）, 醛糖还原酶 (AKR1B1）, 基质金属蛋白酶 12 (MMP1< @2）、基质金属蛋白酶13（MMP13）、B细胞kappa轻肽基因增强子核因子1（NFKB1）、糖原磷酸化酶（PYGL））等，如果8种化合物可以作用于CA2 , 7种化合物可以作用于CA12, 6种化合物可以作用于CA1, 6种化合物可以作用于CA9. 不同的化合物可能作用于同一个靶点, 金银花的抗COVID-19可能是多种成分作用于多个靶点发挥协同效应。

2.4构建PPI网络图

屏幕将目标导入String数据库，置高置信度为0.900获取蛋白相互作用关系，保存为TSV。文件，导入Cytoscape构建蛋白质相互作用网络，得到192个节点和778个（图2）。根据连通度、中间性、紧密度等进行拓扑分析，确定磷脂酰肌醇3-激酶（PIK3CA）、淀粉样前体蛋白（APP）、原癌基因（SRC）、溶血磷脂酸的关键核心靶点受体 3 (LPAR3)、肿瘤蛋白 p53 (TP53)、丝裂原活化蛋白激酶 14 (MAPK14)、鼠肉瘤病毒癌基因 (HRAS)、G 蛋白 α 抑制剂抗体 1 (GNAI1)、G 蛋白 α 抑制剂抗体 3 (GNAI3) 、丝裂原活化蛋白激酶8（MAPK8）等（表2），这些蛋白主要参与炎症反应、免疫调节、抗病毒、解热、镇静等作用，可能是金银花清热解毒的关键蛋白靶点解毒。

为了进一步了解PPI网络的生物学作用，利用Cytoscape的MCODE插件3.7.1对网络进行Cluster module分析，一共12个Cluster 1模块（图3），具体模块信息见表3。分别对12个模块进行GO分析，Cluster 1主要与磷酸鞘氨醇信号通路、炎症反应、钙离子转运等有关， Cluster 2 主要与 G 蛋白偶联受体信号通路、血管收缩调节、内皮素受体信号通路、神经系统发育等有关。 Cluster 3 主要与病毒过程、T 细胞刺激、白细胞转移、免疫反应等有关。 Cluster 4主要与巨噬细胞分化、细胞增殖、细胞外信号调节激酶调控等有关。簇6主要与细胞分化、抗菌反应、神经反应等有关。

2.5个功能富集分析和通路富集分析

使用DAVID对266个靶基因进行GO分类和富集分析，包括生物过程分析、分子功能分析、细胞成分分析（图4）。在生物过程中，作用于氧化还原过程、缺氧反应、药物反应、ERK1和ERK2级联的正调控等；在分子功能水平上，作用于碳酸脱水酶、药物结合、类固醇激素受体活性等；在细胞成分方面，作用于胞质溶胶、细胞质膜、膜筏等。利用Kobas3.0在线软件进行KEGG生物通路分析，结果表明266个靶点主要富集在235个信号通路中，主要与癌症、炎症、免疫、神经系统等有关，包括非小细胞肺癌、小细胞肺癌等癌症相关通路、肿瘤坏死因子（TNF）信号通路、Toll样受体（ TLR）信号通路、白细胞介素17（IL-17）信号通路、Jak-STAT信号通路等炎症免疫相关通路、人类T细胞白血病病毒、人类免疫缺陷病毒1型感染等病毒相关通路，多巴胺突触、轴突引导和其他与神经功能相关的通路。说明金银花可能通过影响与抗炎、免疫调节、抗病毒、解热、镇痛、镇静等相关的蛋白质和通路发挥清热解毒、祛风散热的作用。排名前 20 的通路通过以下方式可视化： Omicshare 在线平台（图 4）。

2.6组件-目标-通路网络图构建

富集分析得到的15种金银花参与免疫炎症通路的主要血液成分和靶点构建，并构建成分-靶点-通路网络图。网络中的三角形节点代表金银花的血液成分，圆形节点代表潜在靶点，凹四边形代表炎症调节通路，边缘代表三者之间的相互作用（图5））。拓扑属性分析表明网络是异构的。性别为0.890，网络中心度0.246，特征路径长度2.775，平均相邻节点数6.627，说明蛋白质是密切相关。 PIK3R1富集13条相关通路，NFKB1富集9条相关通路，HRAS、IL2.0@>TNF和TP53均富集7条相关通路，caspase 3（CASP3），生长因子受体结合蛋白2 (GRB2）, 糖原合酶激酶 3β (GSK3β), 禽肉瘤病毒的推定转化基因 17 (JUN), 丝裂原活化蛋白激酶 10 (MAPK12.3@>, 丝裂原活化蛋白激酶 14 ( MAPK12.4@>、丝裂原活化蛋白激酶8（MAPK2.5@>、蛋白激酶C（PRKCA））在6个相关通路中富集等。多个通路之一它们通过共同的靶点连接，表明认为金银花通过多种途径协同作用在COVID-19的治疗中发挥作用鸟苷酸环化酶 信号通路，这些途径初步解释了金银花清热解毒的药效物质基础和作用机制。

2.6@>

富集分析得到的12条涉及的神经通路与金银花血中的主要迁移成分和靶点相对应，构建成分-靶点-通路网络图。网络中的三角形节点代表金银花的主要转换组件和目标。输入的血液成分，圆形节点代表潜在目标，凹四边形代表神经调节通路，边缘代表三者之间的相互作用（图 6）。拓扑性质表示网络异质性为0.839，网络中心度0.170，平均相邻节点数2.9@>720，特征路径长度2.876，大多数蛋白质非常接近连接的。一种化学成分与多种靶蛋白相互作用，不同的化学成分也可以作用于同一种靶蛋白，表现出金银花的多成分、多靶点、多途径的特点。功效是相关的。

2.7 分子对接结果

分子对接结果显示，金银花的血液成分与新型冠状病毒3CL（SARS-CoV-2 3CL）水解酶和血管紧张素I-转化酶2（ACE2）具有相对稳定的结合和良好的结合活性（表2.4@>）。其中，金丝桃苷与SARS-CoV-2 3CL水解酶和ACE2的ΔG最低，ΔG越低越稳定，最有可能产生一个作用（图7），金丝桃苷可以作为金银花的关键成分发挥抗病毒作用。

3 次讨论

金银花具有清热解毒，散风热之功效，是治疗一切热毒痈肿的必备良药。主要的抗炎成分有绿原酸、新绿原酸、咖啡酸等[14]。金银花中的酚酸类化合物新绿原酸、隐绿原酸、绿原酸对脂多糖刺激的巨噬细胞炎症因子NO、TNF-α、IL-6均有不同程度的抑制作用[15-16]。金银花中的绿原酸、黄酮类化合物和挥发油能促进鸡脾淋巴细胞的增殖，具有增强体外和体内免疫力的作用[17]。绿原酸等有机酸的含量与其抗菌活性呈正相关[18]。金银花提取物中的绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸C、咖啡酸等酚酸和木犀草素、金丝桃素等黄酮类化合物对甲型流感病毒性肺炎小鼠的死亡有一定的保护作用，对β-流感病毒的保护作用能更好。改善流感病毒肺炎小鼠的肺组织炎症[19]。本研究采用分子对接方法探索金银花在抗COVID-19中的潜在活性成分。结果表明，金银花血液中的过渡成分金丝桃苷与 SARS-CoV-2 3CL 水解酶和 ACE2 结合最稳定，最有可能发挥作用。金丝桃苷具有镇痛、抗氧化、抗乙型肝炎病毒和保护心肌和肝脏的作用[20]。金丝桃苷能够抑制肺炎支原体小鼠氧化应激和NLRP3炎症小体的激活，从而抑制肺炎支原体的损伤[21]。金丝桃素作为清肺排毒汤的主要血液成分，作用于COVID-19相关靶点[12]。

本研究发现金银花的血液成分包括7-甲氧基香豆素、3-O-阿魏酰奎宁酸、金丝桃素、绿原酸、新绿原酸和隐绿原酸。 , 癸二酸二丁酯等可能通过干预 PIK3R1, NFKB1, HRAS, IL6, TNF, TP53, CASP3, GRB2, GSK3B, JUN, MAPK10, MAPK14, MAPK8, PRKCA Pathways，调节炎症、免疫、神经等相关信号，如MAPK信号通路、核因子κB（NF-κB）信号通路、磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（PI3K-Akt）信号通路、TLR信号通路、环磷酸腺苷（cAMP）信号通路、钙离子信号通路通路、环磷酸鸟苷-蛋白激酶G信号通路、神经活性配体-受体相互作用等。

MAPK 在炎症过程的激活和细胞因子的产生中起重要作用。活化的MAPK通过核转录因子、细胞骨架和酶的磷酸化参与调节细胞增殖、分化和转化，并与炎症有关。与其他疾病密切相关[22]。 PI3K-Akt通路是调节细胞增殖、凋亡、炎症反应等过程的重要信号通路。磷酸化后调节下游多种基因的表达，外界病理刺激可激活该通路[23]。金银花可抑制核因子κB抑制剂（IκB）的磷酸化，下调NF-κB的活性，增强ERK的磷酸化，上调Sp1的活性，并抑制JNK、p38和STAT的磷酸化。 ，从而拮抗脂多糖诱导的炎症反应。 BALB/c 小鼠的急性肺损伤 [24]。金银花复合物可抑制TLR通路，降低促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α和趋化因子的表达，抑制NF-κBp65、c-Jun、IκBα、κB抑制蛋白激酶α/β（IKKα /β)和干扰素调节因子3(IRF3)磷酸化[25-27]，TLR信号通路可介导NF-κB、MAPK、JAK-STAT等信号通路。

在神经通路方面，文献报道了与解热镇痛相关的通路，包括环磷酸腺苷信号通路、钙信号通路等；糖苷-蛋白激酶G信号通路、cAMP信号通路等；与镇静相关的途径，包括神经活性配体-受体相互作用等[28]。神经活性配体-受体相互作用信号通路是质膜中心与细胞内和细胞外信号通路相关的所有受体和配体的集合[29]。 Ca 2+ 在神经传导、肌肉收缩和舒张、基因转录和信号转导中起重要作用。神经细胞中Ca 2+ 异常引起神经细胞凋亡[30]。因此，金银花中的多种血液迁移成分可能通过作用于多个靶点来调节炎症、病毒、免疫和神经信号通路，从而在 COVID-19 的治疗中发挥作用。

综上，本研究分析了金银花的活血成分和网络药理，初步研究了金银花的清热、解毒、镇静、化痰等主要药用物质及其潜在作用机制。金银花可通过多成分、多靶点、多途径的联合作用治疗COVID-19，为金银花的后续研究提供参考，但还需体外和体内活性评价和药理实验进一步验证。

利益冲突 所有作者声明不存在利益冲突

参考文献（略）

资料来源：刘畅、周志、尹志刚、周颖。基于网络药理学和分子对接技术探索金银花入血成分干预新型冠状病毒肺炎的作用机制[J].现代医学与临床, 2022, 37(2): 264-274 . 回到搜狐，查看更多