解决现有的基于elisa法进行抗体配对筛选的方法介绍

1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于蛋白水解酶切肽图鉴定特征指纹的抗体配对筛选方法。

背景技术：

2.配对抗体是指可以同时与一个抗原分子结合的两种抗体。通常，一个抗原分子具有多个抗原决定簇，将抗原注射到动物体内进行免疫，就会针对不同的抗原决定簇产生不同的抗体。产生的抗体具有特异性和特异性，即一个抗体分子只能与一个抗原决定簇特异性结合。针对不同抗原决定簇的两种抗体可能同时与一个抗原分子结合。如果两个抗体同时结合同一个抗原分子，则它们是配对抗体。

3.配对抗体目前主要用于ELISA试剂盒的生产。配对抗体的筛选方法有双抗体夹心ELISA法、双抗体夹心胶体金免疫层析法等。目前，配对抗体筛选最常用的方法是双抗体夹心ELISA法。具体操作步骤是使用两种可能的配对抗体，一种作为捕获抗体，另一种作为检测抗体；将抗原加入ELISA板后，再加入检测抗体，如果能得到阳性信号，且与抗原含量呈正相关，则说明捕获抗体和检测抗体可以特异性结合抗原。同时，捕获抗体和检测抗体是一对。抗体。该方法可以准确筛选双抗体夹心ELISA法的配对抗体，但酶标、包被和加样过程复杂，操作步骤复杂，反应时间长，通常穷举法只能检测任意两种。候选抗体的组合，当候选抗体数量较多时，工作量极大。

4.有鉴于此，有必要开发一种基于蛋白酶切割肽图鉴定特征指纹的抗体配对筛选方法，可以减少工作量，节约成本。

技术实施要素：

5.本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种基于蛋白酶切割肽图鉴定特征指纹的抗体配对筛选方法。为解决现有基于ELISA方法筛选配对抗体的问题，酶标、包被、加样过程复杂，操作步骤繁琐，反应时间长。通常，任何两种候选抗体的组合只能通过穷举法进行测试。当候选抗体数量较多时，工作量极大。

6.为了解决现有技术中存在的上述问题，本发明通过以下技术方案实现：一种基于蛋白水解酶切肽图鉴定特征指纹的抗体配对筛选方法，包括以下步骤： s1、用消化酶消化目标蛋白，得到蛋白消化片段； s2、以步骤s1得到的蛋白消化片段作为检测样品，候选抗体作为s3、找出步骤s1得到的蛋白酶切割片段的肽图鉴定指纹图谱存在差异的泳道步骤s2，泳道对应的候选抗体为配对抗体，可能有成对配对。

7.进一步地，基于蛋白酶切割肽图识别指纹的抗体配对筛选方法还包括使用双抗体夹心ELISA法比较步骤s3中得到的可能具有成对配对的配对抗体执行确认审核的步骤。

8.进一步，步骤s1中，消化酶选自胰蛋白酶、糜蛋白酶或胃蛋白酶中的一种。

9.进一步，步骤s1中指纹膜制作简单的，消化酶的浓度为0.2～0.5%，酶切反应温度为25～40℃ , 消化反应时间0.5～8h。

10.进一步，步骤s1中，酶切反应体系中的缓冲液为tris-hcl缓冲液，pH为8.0。

11.进一步，步骤s2中，western blot检测的具体方法为：将蛋白酶切割片段与上样缓冲液混合后，煮沸5-10min，sds-page分离；然后放入转运罐进行膜转运，将蛋白酶切割的碎片转移到pvdf膜上；用5%脱脂奶粉室温封闭2-4小时，用封闭液稀释一抗，4℃，一抗封闭过夜； tbst溶液洗涤3次，每次8 min，二抗室温孵育2 h； tbst溶液洗涤3次，每次9 min，用ecl试剂显色，获得蛋白酶切割片段肽图特征指纹图谱。

12.本发明还提供了基于蛋白水解酶切肽图鉴定特征指纹的抗体配对筛选方法在大样本配对抗体筛选领域的应用。

13.本发明的技术原理如下：如果两种抗体对应的蛋白酶切割片段的肽图鉴定特征指纹图谱存在差异，则说明两种抗体抗体识别不同的表位，因此可以通过特征指纹的差异初步筛选配对抗体。

14.与现有技术相比，本发明具有以下优点：基于蛋白酶切割肽图识别特征指纹的抗体配对筛选方法可以快速进行初步筛选，识别不同的鉴定物。 表位抗体，尤其是候选抗体数量较多时，可以有效减少候选抗体的数量，从而减少ELISA配对的工作量。具有操作简单、成本低的优点。因此在配对抗体筛选领域有很好的应用场景。

图纸说明

15. 为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面简要介绍实施例描述中使用的附图。显然，以下描述中的附图只是本发明的一些实施例，对于本领域的普通技术人员来说，在没有创造性劳动的情况下，还可以从这些附图中获得其他的附图。

16. 图。附图说明图1为本发明基于蛋白酶切割肽图特征指纹鉴定的抗体配对筛选方法流程图，其中附图标记为：1：抗原； 2：酶切后的抗原片段；3：western blot； 4：筛选配对抗体； a：胰蛋白酶消化； b：待筛选的目标抗体； c：根据特征指纹的差异进行抗体配对筛选；图2为蛋白酶消化的人血清中待筛选抗体鉴定的白蛋白肽谱特征指纹图谱，其中附图标记为：1：t5d2(0.1μg/ml)； 2：t4h9（0.1 μg/ml）； 3：t5e6(0.002 μg/ml)； 4：t4a1 (0.002 μg/ml)； 5：t4a6 (0.01 μg/ml)； 6：t2c9(0.1 μg/ml)；图3为待筛选抗体鉴定的蛋白酶切割白细胞介素6肽谱特征指纹图谱，左图为曝光30秒的图片，右图为曝光10秒的图片；附图标记：1：k1e9b8b4； 2：k4g3e6e2； 3：k6e3e2g10； 4：k6d1e5c12； 5：k6c4b7g8； 6：k6c12c4a2； 7：k6b1a5g6； 8：k5g2a6a5； k3e12e5e7; 13：k3b4a1e9； 14：k2g11c7b2； 15：k2f12e7a5； 16：k2b9b12c9； 17：k1a5g5c5； 18：k1a4e9a1，浓度均0.1 μg/ml；图4为蛋白酶切割的flt3配体肽待筛选抗体鉴定的光谱特征指纹结果，其中左图为曝光0.5秒的图片，右图为图片曝光 0.1 秒；参考符号为：1：v4e5a6e1； 2：

v4e10e9a8;3:v4d3a5h5;4:v4c7c6b1;5:v4c4g8e7;6:v3e1a3e2;7:v3c9c7h8;8:v3c3g4c3;9:v3a7c7d7;10:v3a5a8a1;11:v2e12e6g1;12:v2d9e1a; ：v2c5c4h2； 15：v2b10g5c6； 16：v1g12c4g11； 17：v1d8e8d11； 18：v1c1h5e3，全部为 0.1 μg/ml。

具体实现方法

17.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下，可以获得所有其他实施例。 ，均属于本发明的保护范围。

18.本发明实施例中使用的三种蛋白质，人血清白蛋白（alb，albin），白细胞介素6（il-6，白细胞介素6），flt3配体，及其对应候选）抗体由武汉三鹰生物科技有限公司自主生产

19.本发明实施例使用的二抗为hrp标记的山羊抗鼠igg(h+1)，购自美国jackson immunoresearch公司。

20.本发明所用的其他常规试剂和设备，除非另有说明，均可从商业上获得。

21.本发明的技术原理如下：如果两种抗体对应的蛋白酶切割片段的肽图识别特征指纹有差异，则说明两种抗体识别不同的表位，因此可以通过特征指纹的差异初步筛选配对抗体。具体的快速筛选方法见图1。

22.实施例1筛选人血清白蛋白配对抗体菌株号为t5d2、t4h9、t5e6、t4a1、t4a6和6筛选t2c9的-株抗人alb小鼠单克隆抗体的抗体配对。具体方法如下：首先取800μg alb用480μl浓度0.25%的胰蛋白酶消化。酶切反应体系温度30℃，酶切反应时间6h；酶切反应体系中的缓冲液为tris-hcl缓冲液，pH为8.0；混合样品缓冲液后，煮沸5-10min，通过sds-page分离；然后将膜转移到转移罐中，将蛋白酶切割的碎片转移到pvdf膜上；用5%脱脂奶粉室温封闭2-4h，用溶液稀释一抗（6种不同的抗alb抗体），4℃封闭一抗过夜； tbst溶液洗涤3次，每次8mim，与二抗（hrp标记的山羊抗小鼠igg(h+l)）室温孵育2h； tbst溶液洗涤3次，每次9min，用ecl试剂显色，得到蛋白酶片段的肽图鉴定指纹；不同泳道，泳道对应的候选抗体为配对抗体，可能有成对配对；最后采用双抗体夹心ELISA法对上述得到的可能具有成对配对的配对抗体进行确认和审核。

结果

23.western blot检测如图2所示，从结果可以看出，对应lane 1、2、3、5的特征指纹为持续的。即对应抗体识别的抗原决定簇在空间上相同或非常接近，因此上述泳道对应的抗体无法配对； 4号车道和6号车道对应的特征指纹也一样，但与车道1、2、3、5有显着差异。因此，车道4、6和1、2、3、5之间只有配对的可能，即配对由原来的（6

×

5）/2=15 组合减少到 2

×

4=8 组合，t4a1 与 t5d2、t4h9、t5e6 或 t4a6，以及 t2c9 与 t5d2、t4h9、t5e6 或 t4a6。

24.此外，在本例中，测试了 t5d2、t4h9、t5e6、t4a1、t4a6 和 t2c9 的六种抗白蛋白抗体进行了hrp标记、成对配对和双抗体夹心ELISA验证。结果见表1-3。

25.表1.1 ELISA验证配对抗体-：ELISA结果为阴性； +：ELISA结果为阳性 从表1.1的结果可以看出，只发现t5e6和t4a1株抗体相互配对，在wb中筛选出8对可能存在的配对抗体，即本发明提供的方法可以显着减少ELISA配对工作中候选抗体的数量，并且能够准确获得有效的配对抗体，适用于较大样本量的抗体配对工作。

26.表1.2 配对抗体的原始ELISA测试数据

从表1.2的结果可以看出，t4h9除了t5e6和t4a1外，还与t5e6或t5d2有一定的配对反应，但显色结果并没有随着稀释的显着下降比率。结合t5e6或t5d2进行验证，结果（详见表1.3））表明抗体t4h9可以直接与t5e6或t5d2结合，因此t4h9与t5e6或t5d2的配对是积极的。 t5e6或t5d2直接结合引起的假阳性，通过本发明抗体配对筛选方法的结果可以消除假阳性。即本发明可以有效减少候选抗体的数量，减少ELISA配对的工作量，并且在一定程度上可以排除由于抗体之间直接结合导致的配对假阳性。

27.表1.3 抗体 t4h9 和 t5e6 或 t5d2 之间的直接结合验证

实施例2筛选人IL-6配对抗体菌株号为k1e9b8b4、k4g3e6e2、k6e3e2g10、k6d1e5c12、k6c4b7g8、k6c12c4a2、k6b1a5g6、k5g2a6a5、k4d8e7g3、k4d12g2a6、k4c7g2a2、k3e12e5e7、k3b4a1e9、k2g11c7b2、@ >k2f12e7a5、k2b9b12c9、k1a5g5c5、k1a4e9a1 筛选18株抗人白介素6（il-6）小鼠单克隆抗体进行抗体配对，具体方法如下如下：首先将10 μg il-6用6 μl浓度为0.25%的胰蛋白酶消化，消化反应温度为35℃，消化反应时间为0.5h；酶切反应体系中的缓冲液为tris-hcl缓冲液，pH为8.0；然后将蛋白酶切片段和蛋白上样缓冲液混合均匀，煮沸5-10分钟, 进行 sds-page 分离；然后将膜转移到转移罐中，转移蛋白酶- 将碎片切割成 pvdf 膜；用5%脱脂奶粉室温封闭2～4小时，用封闭液稀释一抗（18种不同的抗IL-6抗体），4℃一抗封闭过夜; tbst溶液洗涤3次，每次8mim，与二抗（hrp标记的山羊抗小鼠igg(h+l)）室温孵育2h；用tbst溶液洗涤3次，每次9min，用ecl试剂显色，获得蛋白酶裂解片段肽图特征指纹图谱；找出上述蛋白酶切割片段的肽图鉴定特征指纹图谱存在差异的泳道，泳道对应的候选抗体为 配对抗体可能成对存在；最后采用双抗体夹心ELISA法对上述得到的可能配对抗体进行确认。

结果

28.western blot如图3所示，从结果可以看出，15车道对应的特征指纹与其他车道不同，8车道对应的特征指纹与其他车道不同。大多数其他车道。推测15号抗体可能与其他17号抗体配对，而8号抗体可能与其他大多数抗体配对，即(18

×

17）/2 = 153 个组合减少到 2 个

×

17=34 种组合。

29.此外，在本例中，两种抗 IL-6 抗体 k2f12e7a5 和 k5g2a6a5 被 hrp 标记并与其他抗体配对，用于双抗体夹心 ELISA 验证。结果如表2.1-2.3.

30.表2.1 ELISA验证配对抗体-：ELISA结果阴性； +：ELISA结果阳性； /: not detected by table2.1-2.@ >3的结果显示，抗体15 k2f12e7a5可以与其他17个抗体配对，抗体8 k5g2a6a5除了抗体k6e3e2g10（3号），抗体k6b1a5g6（ 7）、k2g11c7b2（13号）和k2b9b12c9（14号），可以与其他13种抗体配对，即本发明提供的方法可以显着减少ELISA配对工作中候选抗体的数量，并且可以准确获得有效配对抗体，适用于大样本量的抗体配对工作。

31.表2.2和k2f12e7a5抗体配对ELISA原始数据

表2.3和k5g2a6a5抗体配对ELISA原始数据

实施例3人flt3配体蛋白配对抗体筛选菌株号为v4e5a6e1、v4e10e9a8、v4d3a5h5、v4c7c6b1、v4c4g8e7、v3e1a3e< @2、v3c9c7h8、v3c3g4c3、v3a7c7d7、v3a5a8a1、v2e12e6g1、v2d9e1a8、v2d4d1g3、v2c5c4h2、筛选了18个@>v2b10g5c6、v1g12c4g11、v1d8e8d11、v1c1h5e3的抗人flt3配体小鼠单克隆抗体进行抗体配对。具体方法如下：首先用6 μl <@ 10 μg flt3配体蛋白用0.25%胰蛋白酶消化。消化反应温度30℃，消化反应时间8h；消化反应体系中的缓冲液为tris-hcl缓冲液，pH为8.0；然后将蛋白酶片段和蛋白上样缓冲液混合，煮沸5-10分钟，通过sds-page分离；然后放置在膜转移的转移罐中，将蛋白酶片段转移到pvdf膜上；室温下用5%脱脂牛奶密封

封闭2-4小时，用封闭液稀释一抗（18种不同的抗flt3配体抗体），4°C一抗封闭过夜； tbst溶液洗涤3次，二抗（hrp标记的山羊抗小鼠igg(h+l)）室温孵育2h； tbst溶液洗涤3次，每次9min，用ecl试剂显色，得到蛋白酶片段的肽图鉴定指纹。找出上述蛋白酶片段的肽谱，识别出特征指纹有差异的泳道，泳道对应的候选抗体即为可能有成对配对的配对抗体；最后采用双抗体夹心ELISA法对上述可能的配对配对进行分析。配对抗体用于确认审核。

结果

32.western blot如图4所示。从结果来看，7号和13号泳道对应的特征指纹是一致的，与其他泳道不同。推测7号和13号抗体可能与其他16个抗体配对，另外10个抗体没有显示条带，说明这些抗体可能只识别全长或只识别特定的构象形式，也有可能两者兼有识别相同的表位或识别不同的表位。正在发生。如果它们都识别相同的表位，则组合由 (18

×

17）/2=153 减少到 2

×

16+10

×

6=92 种；如果识别的表位都不同，则组合减少到 2 个

×

16+10

×

6+ (10

×

9）/2=137 种。本实验选择western blot结果作为探索可能配对情况的信号，即2

×

16=32 种组合。

33.本例中，v3c9c7h8和v2d4d1g3两种抗flt3配体抗体经过hrp标记，并与其他抗体配对，用于双抗体夹心ELISA验证。结果见表3.1-3.3。

34.表3.1 ELISA验证配对抗体-：ELISA结果阴性； +：ELISA结果阳性； /: not detected by 3.1-3. 3的结果表明7号抗体v3c9c7h8和13号抗体v2d4d1g3可以与抗体v3e1a3e2（6号）、v3a5a8a1（6号）配对。 10)、v2e12e6g1(No.11)，即本发明提供的方法可用于ELISA配对工作中候选抗体的数量显着减少，可准确获得有效配对抗体，适用于抗体配对适用于大样本量。

35.表3.2和v3c9c7h8抗体配对ELISA原始数据

表3.3和v2d4d1g3抗体配对ELISA原始数据

综上所述，在实施例1中，针对抗体配对筛选了6种抗人alb小鼠单克隆抗体。经过肽图鉴定和分析，配对由原来的15个组合减少到8个组合。经过wb验证，成功找到一对配对抗体；实施例2中筛选出18种抗人白介素6(il-6）小鼠单克隆抗体进行抗体配对，经肽图鉴定分析后，将原来的配对改变为153种组合。 34个组合，最后经过wb验证，34个组合中只有4个无法配对。配对抗体；实施例3中筛选了18个抗人flt3配体小鼠单克隆抗体进行抗体配对，肽图分析后，10个抗体没有出现条带，说明这些抗体可能只能识别完整的长或只能识别一个特定的构象。如果它们都识别相同的表位，则配对从原来的 153 个组合减少到 92 个组合。 zed表位不一样，配对从原来的153个组合减少到137个组合。根据32个有信号的组合，经wb验证，筛选出6种配对抗体。发现本发明的筛选方法可以显着减少候选抗体组合的数量，并且可以准确获得有效的配对抗体。

36.本发明中，实施例1有6个候选抗体，实施例2有18个候选抗体，实施例3有18个候选抗体，都可以在实施例1-3中筛选出是配对抗体，特别是对于大样本配对抗体的筛选，本发明的方法可以进行快速筛选指纹膜制作简单的，显着减少候选抗体的数量，虽然实施例3中的一些抗体可能只是

它可以识别完整的全长或只能识别特定构象的形式，但从结果可以看出，本发明的筛选方法仍然可以找到配对的抗体。结果表明，本发明的配对抗体筛选方法适用于大样本中配对抗体的筛选，可显着减少候选抗体的数量，能够准确获得有效的配对抗体。因此，在大样本配对抗体快速筛选领域具有良好的应用前景。

37.以上实施例仅为本发明的具体实施方式，用以说明本发明的技术方案，并不用于限制本发明。本发明的保护范围不限于此，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细描述，本领域普通技术人员应当理解，任何熟悉本技术领域的本领域技术人员在本发明公开的技术范围内，仍然可以执行上述实施例中描述的技术方案。可以很容易地想象修改或更改，或者对某些技术特征进行等效替换；并且这些修改、变化或者替换，并不使相应技术方案的实质脱离本发明实施例的技术方案的精神和范围，应当包含在本发明的范围内。在本发明的保护范围内。