一个ATⅢ基因结构和作用机制(图)AT&;

1905年，莫拉维茨的实验数据表明，添加到去纤维蛋白原血症患者血清中的凝血酶会逐渐失去活性，推测血液中存在抗凝血酶。Mclean（1916）从肝脏中提取肝素后，发现肝素必须与血浆成分一起存在才能发挥抗凝作用，因此认为血浆中有肝素辅因子。1950年代的动力学实验表明血浆抗凝血酶 III (ATIII) 活性与血浆肝素辅因子活性直接相关。继 Abildgaard (1968）) 分离出 α2 巨球蛋白后，Rosenber 和 Damus 获得了大量纯化的 ATIII，并证实分离的人 ATIII 和血浆肝素辅因子实际上是同一个分子。

直到 1963 年才报道有患者血浆 AT 测定值偏低，进一步阐明了 AT III 的重要性。很快，Egebeg (1965） 报道了一个 AT 缺陷家族的许多成员患有静脉血栓形成。目前，已知 ATIII 是一种单链糖蛋白，与凝血酶、Xa 因子等丝氨酸蛋白酶形成和纤溶酶。ATⅢ是一种重要的生理性抗凝剂（下图），肝素发挥抗凝作用的辅助因子除了ATⅢ和HCⅡ外，还包括PCI。ATⅢ占辅助因子的肝素依赖性抑制作用的80%。

ATⅢ主要功能区位置示意图

Antithrombin III Antithrombin III 基因结构的结构和机制

并且在3'端含有175个碱基的非翻译区包含一个poly-A序列。第一个内含子含有两个原始转录产物的剪接位点，导致产生两个分子：N端带有信号肽ATⅢ分子或C端缺失多肽分子，后者留在细胞内不分泌，其功能尚不清楚。

抗凝血酶Ⅲ功能域及其对维生素K依赖性蛋白酶的抑制作用

人ATⅢ主要由肝细胞、血管内皮细胞、肺、脾、肠、心脏等细胞合成。它是一种 α2 球蛋白抑制剂，Mr 58 000。正常血浆 AT III 水平约为 140 μg/ml。

一、抗凝血酶 III 反应位点和肝素结合位点

AT III 反应位点 Arg393-Ser394 靠近羟基末端。反应位点赖氨酸可与凝血酶等酶（E）结合，激活中心丝氨酸形成四面体中间体，形成1:1当量共价结合的抑制复合物，即E+AT III→E•AT III 。根据三维结构正常血浆图片，AT III的抑制机制表明其四面体中间产物是酶的陷阱，而不是裂解底物（E）的活化中心键。

在这个过程中，凝血酶在结构上没有改变。凝血酶-ATⅢ抑制复合物易被肝脏受体清除，T1/2小于15分钟。在病理条件下，复合物大部分被清除，随后血浆 AT III 水平降低。

AT III 有两个主要的肝素结合结构域。I区位于氨基酸28-53，包括AT III28、29、的53位赖氨酸，可与肝素结合。区域 II 位于氨基酸 107-156，包括精氨酸的 AT III 107、114、125、126、139 和 129、145。Ⅰ区和Ⅱ区带正电的氨基酸排列成一条直线，使ATⅢ与肝素的硫酸基团通过电子键形成临时复合物，使肝素成为凝血酶的快速抗凝剂。血浆中有少量Asn135的非糖基化ATIII池，该氨基酸位于肝素结合区，对肝素具有增强的亲和力。

肝素-ATⅢ的作用机制

二、肝素催化并迫使凝血酶-ATIII复合物形成并迅速从蛋白多糖上解离

在没有肝素的情况下，凝血酶-ATIII (T-AT) 抑制复合物的形成速度很慢。ATⅢ必须有肝素才能完成其有效的最佳反应速率。这是因为肝素戊糖序列键中的几个硫酸基团通过电子键与ATIII形成临时复合物。复合物的形成可以改变ATIII的构象（上图），使丝氨酸蛋白酶更容易被捕获，从而无法发挥其酶活性而失活。抑制复合物中共价键的形成削弱了ATIII对肝素的亲和力，肝素被释放出来重新使用。在凝血过程中，许多止血酶如IXa、Xa、XIa和XIIa可以被ATIII灭活，灭活方法类似于ATIII陷阱机制。实验表明，肝素与ATⅢ形成酶抑制复合物的结合力比粘多糖与ATⅢ的结合力弱100-1000倍。因此，内皮表面的肝素可以再次游离出来，反复参与蛋白酶的抑制循环。

三、ATIII在抗凝反应中的多糖依赖性加速，对不同介质的影响

ATⅢ-肝素复合物可抑制所有维生素K依赖性凝血因子的活性，但主要抑制FIIa、FXXa、FIXa，FVIIa除外。FVIIa 或蛋白 C (PC) 与 ATIII-肝素复合物的反应非常缓慢。一旦 FVIIa 与组织因子结合，在 Ca2+ 的存在下，该酶的 ATIII 抑制率提高了 30 倍。高分子激肽原（HMWK）可显着加快饱和ATIII-肝素复合物对FVIIa的中和速率。FXIIa 主要被 C1 抑制剂中和。一些实验表明，为了获得灭活凝血酶（FIIa）和FIXa、FXIa的作用，肝素链必须有16个以上的单糖（较大的寡糖），并且必须同时与ATIII和凝血酶等酶结合来形成。三元复合体。

肝素-ATⅢ复合物对 FIIa 或 FXa 的灭活

肝素链苷数与其抗FXa、抗FⅡa的关系

少于 6 个单糖的肝素没有抗 IIa 活性，也不影响活性部分促凝血酶原激酶时间 (APTT)。为了使FXa和FXIIa失活，肝素分子链只需单向结合ATIII即可进行抑制。肝素是否与 FXa 或 FXIIa 结合对抑制过程没有影响。超过 8 个单糖的肝素链可以加速 ATIII-FXa（上图）的相互作用，但不能催化和中和其他止血酶。血栓局部活化血小板释放的血小板因子4(PF4）)可使肝素失去催化失活IIa的活性，但对失活Xa作用不大。由于每个实验中使用的肝素商业剂型不同，链长不同，因此肝素与ATⅢ的结合强度不同，不同肝素制剂对肝素-ATⅢ培养基中和率的报道结果也不同。在肝素单糖序列的特殊组中，结合糖结构增加了ATⅢ-Ⅱa、ATⅢ-Xa在中和率反应中的作用仍在进一步研究中。ATⅢ低亲和力肝素（LAH）的作用尚不清楚。有报道称，LAH可影响血小板功能，导致血小板功能障碍。ATⅢ-Xa中的中和率反应还在进一步研究中。ATⅢ低亲和力肝素（LAH）的作用尚不清楚。有报道称，LAH可影响血小板功能，导致血小板功能障碍。ATⅢ-Xa中的中和率反应还在进一步研究中。ATⅢ低亲和力肝素（LAH）的作用尚不清楚。有报道称，LAH可影响血小板功能，导致血小板功能障碍。

肝素和硫酸肝素蛋白聚糖的化学合成。肝素分子结构和功能异质性

肝素是一种高度硫酸化的氨基聚糖（或糖胺聚糖），是不同长度的多糖链（寡糖）的混合物。由六胺（即N-乙酰氨基葡萄糖或己糖胺）或其衍生物和糖醛酸组成的二糖单元是肝素分子中的主要重复序列，不具有ATIII催化活性。肝素链中特殊的硫酸化戊糖序列是催化 ATIII-E 复合物形成的必要结构。戊糖序列由 N-乙酰氨基葡萄糖（6-OSO3）-葡萄糖醛酸-N-氨基葡萄糖（6-OSO3）-艾杜糖醛酸（2-OSO3）-N-硫代葡萄糖胺）组成6-OSO3）组合物。商业肝素制剂中只有不到1/3的肝素分子具有对ATIII具有高亲和力的戊糖序列。

据报道，一种由特殊的四糖序列组成的八糖，没有硫酸基的艾杜糖-N-乙酰氨基葡萄糖（6-OSO3）-葡萄糖醛酸-Nthio/Othio）氨基葡萄糖，位于还原端，与肝素加速 ATIII-FXa 反应。人体血管内皮表面存在大量类肝素，只有不到10%的天然类肝素链具有抗凝活性。通过各种化学和物理分类方法，可以制备不同分子量的肝素片段和组分，制备出各种具有高生物利用度的新型低分子量肝素（LMWH）制剂。许多研究人员正在寻找一些抗凝活性较弱的类肝素物质，

硫酸乙酰肝素多糖蛋白

Meyez（1938）首先提出将来源于动物组织的含有己糖胺的多糖称为粘多糖（旧称：粘蛋白）。后来发现粘多糖含有糖醛酸和硫酸基团，呈酸性。所以称酸性粘多糖（acidic mucopolysaccharide），现称为氨基（多）多糖（糖胺聚糖），即含有糖醛酸和氨基糖残基的多糖，是一种杂多糖，包括肝素、肝素、硫酸皮质激素、透明质酸、硫酸软骨素、硫酸角蛋白等。在体内，上述各种氨基聚糖的长链与一个核心蛋白相连。糖蛋白称为蛋白聚糖。在国外，肝素称为硫酸肝素蛋白聚糖，而肝素被称为硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（HSPG）来区分它们。

蛋白聚糖的化学合成

蛋白聚糖是一种内皮细胞相关蛋白，具有核心蛋白和肝素侧链。侧链中的糖苷（通过糖苷键连接的单糖）带有ATIII识别序列。近年来，认为内皮下肥大细胞（肥大细胞）颗粒中含有肝素。肥大细胞和血管内皮细胞是肝素合成的主要场所。已知类似于商业肝素的硫酸肝素蛋白聚糖可以从培养的内皮细胞、牛脑微血管和视网膜微血管中获得。硫酸乙酰肝素蛋白聚糖 (HSPG) 由血管内皮合成。已从大鼠微血管内皮细胞中分离和克隆了 cDNA。通过大鼠主动脉的电子显微镜观察内皮细胞相关的类肝素组织学结构。血管腔内膜层含有低浓度的HSPG，管腔表面有大量蛋白多糖池。然而，只有少量（<1%）注入的 ATIII 通过主动脉与管腔壁的内皮细胞发生反应，表明内皮产生的 HSPG 最初是在细胞膜中，然后由血管释放的 HSPG血浆中管腔内蛋白酶的作用主要积聚在血管壁的基底膜上。HSPGs分布在肝脏、心脏、肾脏和肠道等各种器官的肥大细胞表面。从大鼠微血管内皮细胞中分离得到的cDNA克隆表明，只有5%的HSPG能与ATⅢ结合。活性HSPG含有202个氨基酸残基，过去被称为ryudocan；没有ATIII结合活性的313个氨基酸残基过去被称为syndecam。两者具有非常相似的跨膜和细胞内功能区域，但两者的细胞外区域却有显着差异。这个多基因家族的整合膜蛋白具有内皮合成的具有抗凝活性的肝素侧链。

多糖的合成始于糖的蛋白质连接位点与多肽的血清甘氨酸接触形成糖-蛋白质连接序列。之后，聚合物的多糖链在酶的作用下与糖醛酸或N-乙酰氨基葡萄糖（己糖胺）不均匀接触，交替组装，生成的高度不规则的多糖链再进行化学修饰，从而使大部分葡萄糖醛酸被异构化为艾杜糖醛酸（酯），大多数糖胺的乙酰基是 N-硫代取代的。该二糖序列是肝素分子中的主要重复结构，但没有 ATIII 催化活性。糖苷链中只有一小部分葡萄糖醛酸 C2 和己糖胺 C3 和 C6 位发生酯硫酸化（以 2-OSO3 为代表，

肝素链的基本重复结构和戊糖序列

①糖醛酸-己糖胺；②艾杜糖醛酸（酯）-N硫代己糖胺；③戊糖序列

抗凝血酶Ⅲ-肝素的生理作用

用凝血酶和ATⅢ灌注大鼠后腿的实验证实，ATⅢ的抗凝活性与血管内皮密切相关。血管床可加速凝血酶-ATIII复合物的形成，比溶液中这一组分的反应速度快10-20倍。如果在凝血酶之前通过后腿灌注肝素酶，则无法检测到灌注液中酶抑制复合物的水平。进一步的实验表明，凝血酶-ATⅢ复合物的加速形成主要是由于内皮细胞对血管腔表面产生HSPG的影响。在肥大细胞遗传缺陷的小鼠中，内皮细胞HSPG仍能对加速ATⅢ产生完全反应。因此，实验表明，肥大细胞产生的肝素在血管抗凝活性中起很小的作用。推测在生理条件下正常血浆图片，内皮产生的血管腔内只有一小部分HSPG参与调节血管ATⅢ反应；然而，当内皮细胞大面积受损时，管腔表面积累的大量HSPG池将成为凝血级联反应的调节剂。在受损区域的周围环境中，HSPG增强了血浆中ATIII对凝血酶的中和作用。大量积聚在管腔表面的HSPG池将成为凝血级联反应的调节剂。在受损区域的周围环境中，HSPG增强了血浆中ATIII对凝血酶的中和作用。大量积聚在管腔表面的HSPG池将成为凝血级联反应的调节剂。在受损区域的周围环境中，HSPG增强了血浆中ATIII对凝血酶的中和作用。