肽含量检测方法——三氯乙酸氮溶指数的测定

肽含量检测方法-三氯乙酸沉淀法（TCA-NSI）（可溶性小分子含氮物质的定量测定）检测项目检测方法三氯乙酸氮溶解度指数测定设备及实验室样品研磨机或砂浆2.@ > 分析筛：孔径0.45mm（40目）3. 分析天平：电感0.0001g4. 锅炉或电炉5. 滴定管：酸式，1 0、25mL6.锅炉：250mL。凯氏烧瓶：250mL 凯氏蒸馏器：半微型锥形瓶：150、250mL11 容量瓶：100mL mL13.台式离心机：定时、调速，转速可达4000转 14．普通磁力搅拌器 15．移液器：25 mL16。称量样品盘：17个。电热恒温烘箱：可控温度105±2℃试剂1.硫酸：化学纯，含量98%，无氮2.混合催化剂：g五水硫酸铜，g钾硫酸盐为化学纯、研磨和混合 氢氧化钠：化学纯，40% 水溶液 (m/V) 硼酸（GB 628）：化学纯，4% 水溶液（m/V 混合指示剂：甲基红0.1%乙醇溶液，溴甲酚绿0.5%乙醇溶液，两种溶液等体积混合；盐酸标准溶液：邻苯二甲酸盐 甲酸氢钾法标定，按GB 601配制；硫酸铵：分析纯，干燥；三氯乙酸在纯10%水溶液中氮溶解度指数（m/V）的测定 操作方法 取称量皿，250mL烧杯，洗涤6支离心试管，放入烘箱中以后再用。

粉碎研磨，过40目筛网，取筛网约5克置于称重盘中，105℃干燥3小时，取出，盖上称重盘，在干燥器中冷却30min，称重。然后干燥1h，冷却称重，直至两次重量之差小于0.002g，为恒重。恒重后称取m1 g样品（注：样品约2～3 g），放入烧杯中，加入75 mL蒸馏水，室温下电磁搅拌45分钟。将溶液在烧杯中摇匀沉淀，折叠后放入离心试管中，离心后收集上清液（1号上清液）。注：离心速度为 2500 rpm，离心时间为 10 分钟。 4. 取25 mL 1 号上清液，加入25 mL 10%三氯乙酸溶液，混匀，静置20 分钟。将溶液在烧杯中摇匀沉淀，折叠后放入离心试管中，离心后收集上清液（2号上清液）。注：离心速度为 4000 rpm，离心时间为 20 分钟。 5. 取 25 mL 2 号上清液，小心转移到干燥的 500 mL 凯氏烧瓶中，加入 4 g 混合催化剂 6.，然后加入 12 mL 浓硫酸和几颗玻璃珠，摇匀，并将凯氏瓶放在电炉上加热，开小火，待样品焦化，泡沫消失后，加大火力，直至呈透明蓝绿色，然后继续加热至少2h。待样品消解液冷却后，加入20 mL蒸馏水，转移至100 mL容量瓶中，冷却后用水稀释至刻度，摇匀，作为样品分解液。安装好半微量蒸馏装置后三氯乙酸 tca，在接收瓶中加入20mL硼酸吸收液和2滴混合指示剂，将冷凝管下端插入吸收液中。在蒸汽发生器的水中加入几滴甲基红指示剂，硫酸几滴，蒸馏过程中保持液体呈橙红色，否则加入硫酸。

准确吸取10mL样品分解液注入蒸馏装置反应室，用少量蒸馏水冲洗进样口，塞住入口玻璃塞，加入10mL氢氧化钠溶液，小心提起玻璃塞流入反应室，塞住玻璃塞，并在入口处加封，防止漏气。蒸馏5分钟后，降低锥形瓶，使冷凝管末端离开吸收液表面，然后蒸馏1分钟。用蒸馏水冲洗冷凝管末端，洗涤液流入锥形瓶，然后停止蒸馏。 6、蒸馏后的吸收液立即用0.02mol/L盐酸标准溶液滴定，溶液由蓝绿色变为灰红色为终点。必须消耗盐酸标准溶液V1(mL)，滴定结果用空白实验校正。 7、称取样品m2 g（约0.5～1 g），用与步骤5相同的方法测定氮，消耗盐酸标准溶液V2（mL），滴定结果为空白实验校正。三氯乙酸的氮溶解度指数的测定 IV．计算公式 1．三氯乙酸氮溶解指数（TCA-NSI）根据公式（1）：TCA-NSI（%）=（（V1-V0）×m2×75）/ ((V2-V0）×m1×12.@>5）×100 ……(1)其中：m1---测量可溶性氮时称量的样品质量, g;m2——测定总氮时称量的样品质量三氯乙酸 tca，g;V0——空白试验消耗的盐酸标准滴定溶液的体积，mL； V1——消耗的盐酸标准滴定溶液的体积测定可溶性氮时，mL；V乘积，mL；每个样品取两个平行样品测定，以算术平均值作为结果。

富丽肽中小肽含量的测定： 1.1 检测方法：三氯乙酸氮溶解度指数（TCA-NSI） 1.2 原理：三氯乙酸是一种蛋白质沉淀剂，可以沉淀蛋白质和较长的多肽。随着酶解反应的进行，蛋白质的肽链逐渐被切割成大小不一的片段，三氯乙酸的氮溶指数增加。因此，三氯乙酸氮溶解度指数可以准确反映蛋白质的酶解情况，溶解度指数越高，小肽含量越高。 1.3 方法：见标准。 1.4 富丽肽中小肽含量的测定： 上述方法可用于富丽肽中小肽含量的测定。富丽肽所有蛋白质物质中小肽含量≥65%。富丽肽水溶性蛋白物质中小肽含量≥98%。关于富力肽中小肽的分子量谱测定： 2.1 检测方法：基质辅助激光解吸飞行时间质谱（MALDI-TOF-Mass Spectroscopy） 2.2 原理：质谱是肽的重要工具和蛋白质分析，这主要是由于它用于一些软电离技术，其中最具代表性的是基质辅助激光解吸电离（MALDI）。由于其便利性和高灵敏度，该技术已成为蛋白质消化中肽质量指纹识别的最有效工具。 MALDI-TOF-MS以具有紫外吸收的小分子晶体为基质，将分析物与基质结合。

然后用一定波长的激光照射，集中的​​能量加热晶体，使基体晶体升华，将非挥发性分析物释放到气相中。 MALDI主要产生分析物的单电荷离子，将其送入TOF（Time of Flight）分析仪，测量离子从初始光谱到检测端的飞行时间，根据下式确定分子量飞行时间的长短，从而获得蛋白质消化物肽片段的完整分子量图。 2.3 富丽肽中小肽分子量的测定：MALDI-TOF-MS检测结果表明，富丽肽中的水溶性蛋白质物质富含2-6个氨基酸的小肽。肽段的分子量范围为：分子量（道尔顿）摩尔百分比0~16031~65087%651~10008%>10002%1