巧用无缝克隆做点突实验的制备方法来制备载体

熟练使用无缝克隆进行点突变

实验目的：

使用无缝克隆技术进行多点突变。以突变Sgsc基因中的两个位点R50H（AGA-CAT）和L573Q（TTA-CAA）为例。

实验方法：

根据无缝克隆技术原理，设计具有载体同源重组序列和点突变的引物，并通过PCR技术扩增突变片段。然后将突变片段与线性化向量重新组合。

实验试剂和材料：

2×Seamless Cloning Mix（货号：CL117-01）；2×Xerox PCR MasterMix（含染料）（货号：MT209-01）；琼脂糖凝胶纯化和回收试剂盒（货号：DH101-01）；PCR 管 0. 2 ml（货号：QB0201）；NEB10-beta 传感细胞（货号. ：BC113-01）；BM2000+ DNA Marker（货号：MD102-01）；去离子水（货号：SH408-01)；氨苄青霉素钠（货号）编号）：SH101-01）；LB 培养基固体板（含 100 μg/ml 氨苄青霉素）（货号：SH205-01）；50×TAE Buffer（货号： EL102-01）@) >；琼脂糖西班牙（货号 SH5301-01）；高纯度质粒快速提取试剂盒（货号：DP102-01)；2× Fast Taq PCR MasterMix（含染料）（货号：MT202-01）；引物合成（我司提供引物合成服务）；DNA测序（我司提供DNA测序服务）；PCR仪；离心机；超净工作台；电泳机等

实验步骤：

01线性化向量的准备

为了提高克隆效率，最好通过空载体酶切或PCR扩增制备线性化载体。

p>

（1）酶切制备线性化载体，最好采用双酶切法。双酶消化系统如下：

成分

音量

核酸内切酶缓冲液 (10×)

5 μl（终浓度 1×）

空载体质粒（pCEV1 μg/μl）

5微升

萨尔Ⅰ

2微升

BamHⅠ

2微升

去离子水

至 50 微升

37℃点突变技术，消解2小时，消解产物进行琼脂糖凝胶电泳和凝胶切割。 【建议添加到4孔（13颗牙齿）。 , 100 毫升凝胶)]

[琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒（货号：DH101-01）]

(2）如果通过PCR扩增制备线性化载体。PCR产物可用DpnI（货号：CL304-01））消化，然后甲基化载体模板通过凝胶切割回收。

02 设计引物

首先对需要突变的序列进行排列，在序列中标注需要突变的位点，制作突变位点信息表，一方面便于突变位点的设计。该点的重组引物，另一方面，构建完成后，在待突变序列上进行突变修饰，并与质粒测序结果进行对比。

制作突变位点信息表：

野生型位点序列

突变位点序列

R50H

R(AGA)

H(CAT)

L573Q

L(TTA)

Q(CAA)

p>

*“50”代表第50个氨基酸； “573”代表第573个氨基酸。

※注：方框区域黑色字体序列为pCEV载体无缝克隆的同源区。下划线区域为突变位点的同源区域。

根据以上信息设计引物：

含有同源重组序列的引物

reCEVF:GCAATCTAATCTAAGTTTTAATTACAAG

reCEVR:TTCGAAATCAACTTCTGTTCCATG

含有点突变的引物

50HF:ATTGTTGCAAGTTCATAAAGCTCATAAAGCTTTTCATGATGATAGA

50HR:TCTATCATCATGAAAAGCTTTATGAGCTTTATGAACTTGCAACAAT

573QF:CATCTGCAACAATGGAGGCACAAACATTATTCAAGAAGTTAC

573QR:GTAACTTGTTGAATAATTATGTTT

(1)片段 1 (210 bp)

reCEVF:GCAATCTAATCTAAGTTTTAATTACAAG

50HR:TCTATCATCATGAAAAGCTTTATGAGCTTTATGAACTTGCAACAAT

(2)片段 2 (1613 bp)

50HF:ATTGTTGCAAGTTCATAAAGCTCATAAAGCTTTTCATGATGATAGA

573QR:GTAACTTCTTGAATAATGTTTGTGCCTCCATTGTTGCAGATG

@ >

(3)片段 3 (611 bp)

573QF:CATCTGCAACAATGGAGGCACAAACATTATTCAAGAAGTTAC

reCEVR:TTCGAAATCAACTTCTGTTCCATG

3PCR 扩增

(1）PCR扩增系统：

为避免回收浓度低、凝胶孔渗漏等因素，建议扩增3管，即150 μl。

【2×Xerox PCR MasterMix（含染料）（货号：MT209-01)]

(2）PCR循环设置：

通过琼脂糖凝胶电泳和凝胶切割回收PCR产物。

【琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒（货号：DH101-01）】

04突变片段与载体的重组连接

在 0.2 ml PCR 管中建立重组克隆系统：

组件

音量

2×无缝克隆混合物

5 μl（终浓度 1×）

片段 1 (50-80 ng/μl) 210bp

1微升

片段 2 (50- 80 ng/μl) 1613 bp

1微升

片段 3 (50-80 ng/μl) 611 bp

1微升

载体 pCEV (50-80 ng/μl) 6540 bp

1微升

去离子水

至 10 微升

轻柔混合，离心几秒钟，50°C，连接 15 分钟。

05 转型

(1）从-80°C冰箱中取出感受态细胞并置于冰上

(2）在刚解冻的50 μl或100 μl NEB10-beta感受态细胞中加入5-10 μl连接产物，轻轻混匀；

(3）在冰上放置 20-30 分钟；

(4）42℃，热激90秒；

(5）冰2分钟；

(6）加入900μl非抗性LB液体培养基，200转，37℃，培养60分钟；

(6）7） 室温离心1分钟，弃上清900μl，用100μl LB轻轻悬浮沉淀，取50μl菌液铺在LB固体板上培养基中含有 100 μg/ml 氨苄青霉素（pCEV 载体是氨苄青霉素抗青霉素）。剩余菌液可置于4°C，视生长条件而定。

(8）37°C点突变技术，过夜反转。

06 阳性克隆鉴定

(1）菌落PCR法；

(2）限制性内切酶分析法；

(3）DNA测序法。

07突变后的测序结果

(1）R50H突变位置峰值图：

GTTCATAAAGCTCATAAAGCTTTTCATGATG

1）4@>

(2）L573Q突变位置峰值图：

AACAATGGAGGCACAAACATTATTCA

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产品名称

规格

价格（元）

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