基于突变基因的特定氨基酸序列和蛋白质结构的关系研究

体外定点诱变是研究蛋白质结构与功能之间复杂关系的有力工具，也是实验室常用的基因修饰/优化方法。蛋白质的结构决定了它的功能，两者之间的关系是蛋白质组研究的重点之一。对已知基因的特定碱基进行定点改变、缺失或插入，可以改变相应的氨基酸序列和蛋白质结构。研究突变基因的表达产物，可以帮助我们了解蛋白质结构与功能的关系，探索蛋白质结构与功能的关系。结构/域。利用定点诱变技术对基因进行修饰，大家都很熟悉了：比如野生型绿色荧光蛋白（wtGFP）在紫外光激发下可以发出微弱的绿色荧光。 GFP可在可见光波长范围内激发（吸收区红移），发光强度比原来强数百倍，甚至出现黄色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白等。定点诱变技术的潜在应用领域非常广泛，例如研究蛋白质相互作用位点的结构，修饰酶的不同活性或动力学特性，修饰启动子或DNA作用元件，提高蛋白质的抗原性或稳定性、活性、研究蛋白质的晶体结构，以及药物开发、基因治疗等。

对于单点诱变，Stratagene 的 QuikChange 定点诱变试剂盒是一个不错的选择。通过巧妙的设计，质粒定点诱变技术变得简单有效。必须使用纯化试剂盒 (Miniprep) 或氯化铯从常规大肠杆菌中纯化和提取要突变的质粒。设计一对含有突变位点的引物（正向和反向），模板质粒退火后使用PfuTurbo聚合酶“循环延伸”。 5'端终止，然后经过反复加热和退火延伸的循环。该反应不同于滚环扩增，不会形成多个串联拷贝。）退火后，正向和反向引物的延伸产物配对形成带缺口的开环质粒。 DpnI酶切延伸产物，因为原始模板质粒来源于常规大肠杆菌，经过dam甲基化修饰，对DpnI敏感，被切割成碎片（DpnI识别序列为甲基化GATC，GATC在几乎各种质粒中，体外合成的突变序列的质粒因为没有被甲基化点突变技术，所以没有被切割，所以在后续的转化中可以成功转化，得到突变质粒的克隆。对DpnI和合成对DpnI消化不敏感的突变质粒，用酶去除模板质粒，得到突变质粒，操作简单有效。聚合酶，堪称高保真聚合酶的“金标准”，是Stratagene的看家宝， ch 可以有效避免扩展过程中不必要的不​​匹配。该试剂盒使用低循环延伸而不是 PCR，这有助于减少意外错配。只需一次消化转化，一天即可完成实验。该试剂盒适用于大小不超过 8Kb 的质粒。后面介绍的 QuikChange XL 定点诱变试剂盒针对大于 8Kb 的质粒进行定点诱变。通过优化试剂，尤其是其感受态细胞 (XL10-Gold)，较大质粒的定点诱变同样简单。 QuikChange 因其简单性和效率 (>80%) 广受欢迎，仅在今年前 9 个月就发表了 400 多篇论文。

比较有特色的定点诱变产品包括Clontech的Transformer Site-Directed Mutagenesis Kit，需要根据质粒设计两个引物（同向，同一个单链模板）突变，一个包含计划的定点诱变。另一条引物的序列在质粒上含有单个限制性酶切位点，但在单个限制性酶切位点中引入了一个突变，使得两条引物除了包含的突变位点外，与处的序列完全相同质粒上的相应位置。一致地，在退火后，它与质粒模板结合并被 T4 DNA 聚合酶延伸。延伸反应一直持续到遇到另一个引物并停止。含有突变位点的两条延伸产物通过T4连接形成环点突变技术，并与模板链形成杂环。有两个不匹配。单酶裂解反应产物直接转化为Ecoli BMH 71-18 mutS（错配修复缺陷株）。原始双链质粒模板被切割不能转化，而杂合质粒由于在一条链上的单个酶切位点引入突变而不能被切割，环状质粒可以转化。在大肠杆菌的复制过程中，将转化体的杂合链和双链分离，再经过一轮质粒提取、单酶消化、转化，最终得到纯突变质粒。本试剂盒使用修饰的单限制酶位点，使新合成的突变质粒不被切割以去除原始模板质粒。虽然这个试剂盒比上一个更麻烦，但它实际上引入了两种定点诱变。只是模板的酶切反应。

有时研究可能需要对多个位点进行定点诱变，例如修改酶的活性或动力学特性，研究蛋白质之间的相互作用位点等。单位点突变不能满足实验需要，需要反复进行单位点突变点突变也非常耗时。因此，Stratagene 推出了 QuikChange 多位点定向诱变试剂盒。在一个实验中最多可以引入 5 个定点诱变。本试剂盒原理与Clontech类似，即制备多条带突变的引物（方向相同，指向同一个单链模板），退火后将所有突变引物（不超过5条）组合在相同的环状单链模板，PfuTurbo 聚合酶在遇到下一个引物时会延伸并停止。每个片段连接成一个环，并与单链模板形成一个杂环。 DpnI消化了双链模板，也消化了杂环中的模板，只留下新合成的模板。具有多个突变的单链环（突变ssDNA）可以转化到大肠杆菌中形成双链质粒。数据显示，引入3定点诱变的效率为60%，5定点诱变的效率为30%。获得的其他质粒是具有较少定点诱变的质粒。以引入3个定点诱变为例，大约40%的转化质粒是1-2个不同定点诱变的质粒（因为有1-2个定点诱变）。引物结合模板延伸形成单链环）。这样在一次实验中就可以得到不同突变数量的质粒，对于研究蛋白质结构与功能的关系也很有帮助。

与定点诱变不同的是基于 PCR 的随机诱变，它通过改变 PCR 条件来改善 PCR 过程中的随机错误。这种方法适用于对未知蛋白质进行全局分析，所以称为饱和诱变。 ）。但由于这种方法没有目的，分析操作相当繁琐，而且一个位点不会发生超过2个碱基的突变，因此在应用上有一定的局限性。定点诱变适用于已初步了解蛋白质结构的基因。与PCR的随机突变相比，它更具目的性、准确性、简单性，同时对基因的修饰也更加“随意”。由于定点诱变技术在蛋白质组学中有着非常广阔的应用前景，相信在不久的将来该技术会得到进一步的完善和发展，让更多的人熟悉该应用。

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