由基因工程酶鸡尾酒推动的低成本第二代乙醇生产

里氏木霉真菌RUT-C30菌株，经工程改造可产生高产酶。

巴西研究人员利用基因工程技术开发了一种低成本平台，用于生产分解甘蔗垃圾和甘蔗渣并转化为生物燃料的酶。新型分子具有许多潜在的工业应用。

巴西能源与材料研究中心（CNPEM）的研究人员对一种真菌进行了基因改造，以产生一种酶混合物，该酶可以分解生物量中的碳水化合物，例如甘蔗垃圾（顶部和叶子）和甘蔗渣，转化为可发酵的糖，用于工业生产。有效地转化为生物燃料。

低成本酶混合物的开发是生产第二代乙醇的主要挑战之一。

第二代生物燃料是由各种非食品生物质制成的，包括农业残留物，木片和废食用油。CNPEM研究小组的程序为优化利用甘蔗渣生产生物燃料铺平了道路。

里氏木霉属真菌是植物细胞壁降解酶最丰富的生产者之一，被广泛用于生物技术行业。为了提高作为所述酶混合物的生物工厂的生产率，研究人员向RUT-C30（一种可公开获得的真菌菌株）引入了六种基因修饰。他们为该工艺申请了专利，并在《生物技术用于生物燃料》杂志上发表了一篇文章。

“对真菌进行了合理的修饰，以最大限度地提高这些具有生物技术意义的酶的产量。使用CRISPR / Cas9基因编辑技术，我们修饰了转录因子以调节与酶相关的基因的表达，删除了引起酶混合物稳定性问题的蛋白酶，并添加了真菌自然缺乏的重要酶。结果，我们能够使真菌从农业工业废料中生产出大量酶，而巴西是一种廉价而丰富的原料。” CNPEM生物可再生实验室（LNBR）的科学总监Mario T. Murakami对AgênciaFAPESP说道。

根据国家食品供应公司（CONAB）的数据，巴西每次收成加工的甘蔗约有6.33亿吨，每年产生7,000万吨的甘蔗垃圾（干重）。该废物未充分利用来生产燃料乙醇。

村上隆强调说，巴西几乎所有用于分解生物质的酶都是从一些外国生产商进口的，这些生产商将这项技术置于商业秘密保护之下。在这种情况下，进口的酶混合物可占生物燃料生产成本的50％。

他说：“在传统模式下，需要数十年的研究来开发具有竞争力的酶混合物生产平台。”“此外，鸡尾酒不能仅通过合成生物学技术从公开获得的菌株中获得，因为生产者使用不同的方法来开发它们，例如适应性进化，将真菌暴露于化学试剂中以及诱导基因组突变以便选择最有趣的表型。现在，由于有了CRISPR / Cas9等先进的基因编辑工具，我们成功建立了一个竞争平台，并在两年半的时间里进行了一些合理的修改。”

CNPEM研究人员开发的生物过程每升产生80克酶，这是迄今为止从低成本的糖基原料中获得的里氏木霉的实验支持最高滴度。这是以前科学文献中报道的真菌浓度（每升37克）的两倍以上。

村上说：“这项研究的有趣之处在于，它不仅限于实验室。”“我们在半工业生产环境中测试了该生物工艺，并将其放大以用于中试工厂，以评估其经济可行性。”

他补充说，尽管该平台是为从甘蔗渣中生产纤维素乙醇而定制的，但它可以分解其他种类的生物质，高级糖可以用于生产其他生物可再生能源，例如塑料和中间化学品。

新型酶类

该过程是LNBR进行广泛研究以开发能够分解碳水化合物的酶的实际结果（就工业应用而言）。在另一项由FAPESP资助并发表在《自然化学生物学》上的研究中，研究人员揭示了真菌和细菌中最主要存在的7种新型酶。

新型酶属于糖苷水解酶（GH）家族。村上隆表示，这些酶不仅在生物燃料领域而且在例如医学，食品加工和纺织品中都具有巨大的应用潜力。这些酶将利用自然界中分解多糖（由许多简单糖组成的碳水化合物）的不同方式来激发新的工业过程。

这些酶分解了β-葡聚糖，这是谷物，细菌和真菌的细胞壁中发现的一些最丰富的多糖，以及世界上大部分可利用的生物质，表明该酶在食品防腐剂和纺织品中的潜在用途。就生物燃料而言，关键特性是其消化富含植物纤维材料的能力。

村上说：“我们着手研究自然界中降解多糖的能力以及如何将这些知识应用于不同行业的工艺中。”除了发现新型酶外，这项研究的另一个重要方面是我们使用相似性网络方法来产生关于该酶家族的系统性和深刻的知识。该方法使我们能够从头开始，并在相对较短的时间内，得出迄今为止对β-1,3-葡聚糖具有活性的酶研究最为深入的家族，并提供了有关特异性和作用机制的信息。

酶分类的主要标准通常是系统发育，即分子的进化历史，而CNPEM研究人员则专注于功能性。

“由于DNA测序技术的进步，我们现在拥有许多已知的遗传序列，并且具有根据分子和酶的功能研究和表征分子和酶的成熟能力。因此，我们已经能够改进相似性网络方法，并首次将其用于研究对多糖具有活性的酶。”村上隆说。

该小组使用相似性网络方法，根据功能对酶的七个亚家族进行了分类。研究人员表征了每个亚家族的至少一个成员，系统地研究了降解成千上万个酶家族成员所含β-葡聚糖的分子策略的可行性。

生化之旅

系统发育分析关注的是随时间推移而保守的DNA区域，而按功能分类则基于与功能分化相关的非保守区域。村上说：“这提高了我们的效率，使我们能够将1000多个序列分为功能相同的七个子组或类。”

由于该方法新颖，研究人员还进行了其他一些研究，以仔细检查并验证分类方法。他们从能够降解多糖的七种酶中，获得了24种全新结构，包括各种底物-酶复合物，这些结构被认为在提供信息以帮助理解所涉及的作用机制方面至关重要。

该研究包括功能和结构分析，以了解这些酶如何作用于有关的碳水化合物。村上说：“多糖具有数十种构型，并具有多种化学键的能力。”“我们想确切观察每种酶识别哪些化学键和结构。因此，必须进行多学科研究，将结构和功能数据结合起来，并使用质谱，光谱学，诱变和衍射实验进行分析，以阐明原子结构。”

在同一期《自然化学生物学》的“新闻与观点”部分中，英国约克大学生物无机化学主席Paul Walton教授将糖苷水解酶研究评为“它的创新方法并赞扬它的“巨大见解”，并补充说，研究人员“能够表达和分离每个酶类别的样本，以检查这些类别之间的序列差异是否反映在它们的结构和活性中。”

参考：

Camila R.β Santos，Pedro ACR Costa，PlínioS. Vieira，Sinkler ET Gonzalez，Thamy LR Correa，Evandro A. Lima，Fernanda Mandelli和Renan AS撰写的“对糖苷水解酶家族对-1,3-葡聚糖进行切割的结构性见解” Pirolla，Mariane N.Domingues，Lucelia Cabral，Marcele P.Martins，Rosa L.Cordeiro，AtílioT.Junior，Beatriz P.Souza，ÉricaT.Prates，Fabio C.Gozzo，Gabriela F.Persinoti，Munir S.Skaf和村上万里（Mario T. Murakami），2020年5月25日，《自然化学生物学》。
10.1038 / s41589-020-0554-5

保罗·沃尔顿（Paul H.Walton）的“酶使工作成真”，2020年6月17日，自然化学生物学。DOI：
10.1038 / s41589-020-0585-y

卢卡斯·米兰达·丰塞卡（Lucas Miranda Fonseca），卢卡斯·萨莱拉·帕雷拉斯（Lucas Salera Parreiras）和村上马里奥·泰亚戈·村上（Mario Tyago Murakami），“里氏木霉RUT-C30菌株的合理工程进入纤维素酶生产的工业相关平台”，2020年5月22日，生物燃料生物技术。DOI：
10.1186 / s13068-020-01732-w