第2025色谱层析法快速,简便的方法有哪些？

测定大豆蛋白水解度的简单方法 No. 2025 色谱法。该方法将大豆蛋白水解肽溶液采用蛋白快速纯化系统进行G-25层析，根据蛋白峰和肽峰面积计算蛋白水解度，并与甲醛滴定法进行比较。结果表明，G-25色谱法测定大豆蛋白的水解度略低于甲醛滴定法。该方法快速简单。可以普遍适用于每个关键词：大豆蛋白；水解度； G. 25 层析 CLC 号：565.1 美元； Q51 文献代码：A 文章编号：1009—3907（2010)06—0025—04 大豆蛋白是目前植物蛋白的最重要来源，含有人体必需的全部8种氨基酸，其比例是合理的。氨基酸含量与动物蛋白相近，尤其是赖氨酸含量可以达到动物蛋白的水平。但大豆蛋白分子量大，溶解度低，含有胀气因子、胰蛋白酶抑制剂、抗营养血凝素等因子易受温度、pH等物理化学因素的影响，并具有一定的抗原性，其消化率和生物利用度远不及鸡蛋、牛奶等动物蛋白。大豆多肽是被蛋白酶水解的大豆蛋白. 形成多种低分子量多肽混合物，通常由3-6个氨基酸组成大豆蛋白水解度，其分子量主要分布在1000Da左右。 e具有与大豆蛋白相同的氨基酸组成，消除了对人体有害的各种抗营养因子。其抗原性较低，溶解性好，易吸收，具有提高免疫力、抗疲劳、降低胆固醇等多种生理功能。

因此，大豆肽得到了广泛的研究和应用。在实际生产过程中，用水解度（DH）来反映大豆蛋白的水解程度。测定蛋白质水解程度的方法有茚三酮法、甲醛滴定法、三硝基苯磺酸法（TNBS）J、pH-STATI3等。国外通常采用pH-STAT法，但这种方法需要专用仪器。国内通常甲醛滴定法和茚三酮法以单一氨基酸为标准，但不同氨基酸茚三酮显色存在偏差，比色时读数不稳定，结果不够准确。甲醛滴定法比较简单，但测定值偏低。 TNBS法较为准确大豆蛋白水解度，但分析方法复杂，所用试剂不易获得。本文介绍了一种测定蛋白质水解度的新方法，利用蛋白质快速纯化系统，将大豆蛋白水解多肽溶液通过25层色谱，根据蛋白质峰面积计算蛋白质的水解度。和肽峰。与甲醛滴定法相比，这种方法更简单、更容易。原料酶（南宁庞博生物工程有限公司）、碱性蛋白酶、中性蛋白酶（无锡酶制剂厂）、风味蛋白酶（丹麦诺维信（中国）生物科技有限公司）等药品均为国内分析纯。主要试剂：（1)甲醛溶液（提前调至中性）、（2)标准NaOH溶液（0.

1moL/L), (3)酚酞溶液(1%)。1.2 主要仪器和设备蛋白质快速层析系统AKTAEXPLORER100 (GE Company, USA), SephadexG-25Medium gel (GE Company, USA)),冷冻干燥机FDU-2100（13 EYELA公司），精密酸度计pHS-2（上海雷磁仪器厂），高速冷冻离心机J-26XP（美国BECKMANCOULTER公司），恒温水浴箱DK。 98型（天津试验仪器公司），磁力搅拌器基金项目：吉林省教育厅“十一五”科技攻关项目[2008第36526号长春大学学报20CJJ78.1型（江苏金坛医疗器械厂） ）。 1.3 实验方法 1.3.1 大豆多肽制备工艺路线及酶解条件 取大豆分离蛋白 1 g，各加入 100 mL 蒸馏水，搅拌均匀，在合适的温度和 pH 条件下加入蛋白水解酶 10000 U/g水解5h，90～C灭活酶10min，加入三氯乙酸(TCA)调节pH3.5～4.0使未水解蛋白沉淀，8000rpm/min离心15min，取上清液冻干。选择了四种大豆蛋白。水解酶，分别为碱性蛋白酶、中性蛋白酶、大豆蛋白修饰酶和风味酶。 1.3.2 总氮含量的测定蛋白质含量的测定方法采用GB/T5009。

5-2003 食品中蛋白质的测定。 1.3.3 蛋白水解度的测定 将5mL加入标有数字的100ml锥形瓶中。 1.3.5 G-25层析法测定蛋白水解度取G-25层析柱（10700mil1)连接到蛋白质快速层析系统。以蒸馏水为流动相平衡柱体积，取2mL 2.1 甲醛滴定法测定大豆分离蛋白的水解度 可以看出，选择的四种蛋白水解物酶均达到了较高的水解度，其中碱性蛋白酶水解效果最好，碱性2.2G-25层析分离大豆分离蛋白水解物-25层析分离大豆分离蛋白水解物的洗脱曲线如图1所示。 B、C、D分别为风味酶、大显蛋白修饰酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶 水解溶胶的G-25洗脱图从大豆分离蛋白水解物的G-25洗脱图可以看出，大豆分离蛋白酶解物的G-25色谱图基本有2~3个峰。最大的蛋白质峰，虽然大豆分离蛋白是多种蛋白质的混合物，后面加入的蛋白水解酶也是大分子蛋白质，但由于G-25凝胶的分离范围为1000-5000 Da，这些大分子蛋白质并没有被G-25。 G-25凝胶色谱分离，但大豆分离蛋白的酶解程度不同的肽混合物峰，分子量不高于10个数量级，在G-25凝胶的分离范围内，但由于太多多肽混合物的种类，分子量差异不大，呈现出一个带肩峰的慢峰，而且只有风味酶的多肽峰是两个独立的洗脱峰，这可能是因为风味酶是一种混合酶，还有二次酶解过程，即酶肽再次水解。变成更小的寡肽甚至氨基酸。

层析中使用的G-25凝胶柱需要8000以上的柱效才能保证大豆肽的完全分离。 G-25层析分离大豆分离蛋白的洗脱峰面积结果见表2。表3G-25层析结果和水解度可以看出G-25层析法略低于甲醛滴定法测得的大豆分离蛋白水解度值，这可能是因为添加的额外蛋白酶增加了蛋白峰面积。两种方法的偏差在0.5～1.3之间，两组数据基本呈线性关系，G-25色谱法G.25色谱法是测定大豆分离蛋白水解度的直接方法。 G-25凝胶层析用于分离蛋白质和肽以计算蛋白质的水解程度。与传统的甲醛滴定法相比，该方法的测定结果较低，因为在酶解体系中加入了水解酶蛋白。该方法简单快速，不仅可以提供蛋白质水解程度，还可以提供更直观的酶解多肽水解结果。但党 [2] Adler-NissenJ.三硝基苯磺酸法测定食品蛋白水解物的水解度[J]. JAcFoodChem，[3] Alder?NissenJ。食品蛋白质的酶解[M]. 1~ndon：爱思唯尔应用科学出版社，1986：12-14。

（长春大学农产品加工重点实验室，长春130022）摘要：本文介绍了一种新的方法，G?25色谱法，测定大豆蛋白的水解度，采用快速蛋白纯化系统完成大豆蛋白水解多肽溶液中的G-25色谱法。蛋白质的水解程度由蛋白质峰和肽峰的比例来计算。结果表明，该方法的DH值略低于甲醛滴定法。这种方法既快捷又方便，可以在各种情况下使用[1]谢元喜，唐家士。

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