蛋白质测序是确定全部或部分蛋白质或肽的氨基酸序列的实际

蛋白质测序是确定蛋白质或肽的全部或部分氨基酸序列的实用程序。蛋白质测序还可用于鉴定蛋白质或表征其翻译后修饰。通常蛋白水解度，蛋白质的部分测序可提供足够的识别（一个或多个序列标签）。

蛋白质测序的两种主要直接方法是质谱法和使用蛋白质测序仪（测序仪）的 Edman 降解测序。蛋白质测序和鉴定应用最广泛的方法是质谱法，而埃德曼降解法是表征蛋白质N端最重要的方法之一。

确定蛋白质的氨基酸组成

通常我们想在找到有序序列之前知道蛋白质的氨基酸组成，这有助于我们发现测序过程中的错误并纠正最终结果。了解蛋白质样品的氨基酸组成有助于确定哪些蛋白酶适合水解该蛋白质，以及识别蛋白质中低水平的非标准氨基酸掺入错误，例如正亮氨酸。确定氨基酸组成的一般方法通常称为氨基酸分析：

1. 将已知量的蛋白质水解成其组成氨基酸；

2.以合适的方式分离和量化氨基酸。

蛋白水解

水解是通过将蛋白质样品在 6 M 盐酸中加热到 100–110 °C 并保持该温度 24 小时或更长时间来完成的，具有许多大疏水基团的蛋白质可能需要更长的加热时间。然而，由于这些反应条件非常苛刻，以至于一些氨基酸（丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、色氨酸、谷氨酰胺和半胱氨酸）被降解。为了解决这个问题，Biochemistry Online 建议可以通过将不同样品加热不同时间来分析每种得到的溶液，并推断出零水解时间。 Rastall 建议使用各种防止或减少降解的试剂，例如硫醇试剂或苯酚，以保护色氨酸和酪氨酸免受氯影响，并预氧化半胱氨酸。他还建议通过测量氨的释放量来确定酰胺水解的程度。

氨基酸分离定量

可以通过离子交换色谱分离氨基酸，然后进行衍生化以帮助检测。一种更常见的方法是将氨基酸衍生化，然后通过反相 HPLC 将它们分离。

以 NTRC 提供的离子交换色谱为例：使用磺化聚苯乙烯作为基质，将氨基酸添加到酸性溶液中，并用逐渐增加 pH 的缓冲液冲洗色谱柱。当 pH 值达到其各自的等电点时，氨基酸被洗脱。一旦氨基酸被分离出来，每个氨基酸的量可以通过添加一种形成有色衍生物的试剂来确定。氨基酸量超过10 nmol可使用茚三酮；与脯氨酸反应呈黄色，与其他氨基酸反应呈亮紫色。氨基酸浓度与所得溶液的吸光度成正比。只需少量（低至 10 pmol）这种溶液即可与邻苯二甲醛 (OPA) 或荧光胺等试剂形成荧光衍生物。柱前衍生可以使用Edman试剂产生可以被紫外光检测的衍生物，使用产生荧光衍生物的试剂可以获得更高的灵敏度。通常使用 C8 或 C18 硅胶柱和优化的洗脱梯度通过反相色谱分析衍生的氨基酸。每种氨基酸的定量是通过使用紫外或荧光检测器检测洗脱的氨基酸并将峰面积与衍生标准品的峰面积进行比较来完成的。

本文由Biotech Biotech编辑编辑。

Biotech专注于质谱技术，主要提供蛋白质理化性质分析和结构分析，以及基于质谱的蛋白质组学和代谢组学技术服务。公司致力于建立国际领先的蛋白质研究与分析技术平台，为科研院所和高校提供高效、准确、高性价比的蛋白质（群）研究技术包蛋白水解度，协助客户开展基础研究、分子诊断等生活科学研究领域。取得突破，为生命科学的发展做出贡献。