一种利用生物传感器快速测定鱼皮胶原蛋白水解度的新方法技术领域

一种利用生物传感器快速测定鱼皮胶原蛋白水解度的新方法

法律

技术领域：

[0001] 本发明涉及一种测定胶原蛋白水解度的方法，属于应用生物技术领域。具体而言，涉及使用谷氨酸氧化酶生物传感器测定胶原蛋白水解度的方法。本发明的方法用于测定水解度，准确、快速，30s内即可获得数据，并可连接微机实现打印、数据分析和自动控制功能，可应用于一般实验室分析，也可用于胶原酶。在活性肽工业化生产中的应用。

背景技术：

[0002] 水生动物所含的胶原蛋白与陆生哺乳动物所含的胶原蛋白具有相同的特性。它们都是由三个多肽链组成的三螺旋结构。氨基酸的主要成分也是甘氨酸和脯氨酸。和羟脯氨酸。同时，水生动物体内的胶原蛋白也有自己的特点和功能。

[0003]与陆生动物相比，水生胶原蛋白具有自身的特点。鱼胶中脯氨酸和羟脯氨酸的含量远低于动物胶，而鱼胶中蛋氨酸的含量远高于动物胶。由于鱼胶中脯氨酸和羟脯氨酸的含量低于陆生动物胶，因此在生产过程中蛋白质结构容易被破坏，导致其蛋白质成分中几乎没有Y成分，而中低分子量的含量α组分较多，鱼胶的胶温低于陆生动物胶。

[0004] 胶原蛋白含有多种生物活性肽，如抑制血管紧张素转化酶活性、抑制血小板聚集活性、抗氧化活性、抗肿瘤活性等。胶原蛋白活性肽是以胶原蛋白为原料，经水解后的产物通过多种蛋白酶定向梯度，其分子量在2000Da以下。目前，生产活性肽的途径主要有以下三种：（1)从天然生物中提取；（2)体外酶解产生的蛋白质；（3)化学合成和重组） DNA技术。不同的生产方法各有特点，取决于目的肽的长度、数量和用途。天然产物中生物活性肽的含量很少，可以作为生物活性肽进行研究，但它是做食品不可行。化学合成这种方法被广泛用于生产高价的医药级多肽，但成本高，副产物对人体有害。重组DNA技术合成方法也是应用广泛，但这种方法多用于生产长肽和蛋白质，而且很多生物活性肽都是短肽，所以这种方法的使用也受到限制。 y优点，即生产条件温和、安全性高、成本低、反应时间可控，可获得特定的活性肽 目前，酶法在生物活性肽的生产中被广泛采用。在蛋白质水解产品的开发中，多肽的开发可能会为传统食品行业开辟新的机遇。

[0005] 虽然酶法生产生物活性肽具有诸多优势，但在工业上酶解制备活性肽时，酶解过程仍然复杂、繁琐且难以控制。一种可用于生产控制的测定方法，控制酶解过程，从而实现酶解制备活性肽的规模化生产。

发明内容：

[0006] 本发明的目的在于解决酶解制备活性肽时酶解过程复杂、繁琐、难以控制的问题。本发明可以提供一种快速、准确测定酶解物水解度的新方法。

[0007] 步骤一：碱性蛋白酶水解液的制备。最佳水解温度45℃，pH＜@k3@＞5，加酶量90mg/kg条件下，制备底物浓度为5%，酶解时间分别为＜@k4@＞5h，＜碱性蛋白酶水解液对于@2. 哦水解度公式，<@2. 5h，3. 哦，3. 5h，4. 哦，4. 5h。

[0009]步骤2：碱性蛋白酶水解物谷氨酸含量和水解度的测定。

[0010]通过电位滴定法测定上述酶解产物的水解度。移取 5ml 酶解产物至 100ml 容量瓶中，定容。吸取20ml于200ml烧杯中，加入60ml蒸馏水，开启磁力搅拌器水解度公式，用0. 05mol/L NaOH标准溶液滴定至酸度计指示的pH8.2，记录数ml消耗的NaOH；然后加入10ml 40%中性甲醛，搅拌均匀。继续用上述NaOH标准溶液滴定至pH9.2，记录每毫升NaOH标准溶液的消耗量，同时做空白实验。测量结果示于图1。 1.随着酶解时间的延长，鳕鱼皮胶原蛋白的水解度呈逐渐升高的趋势。

[0011]谷氨酸含量采用SBA-40C型生物传感器分析法测定。打开它，它会自动清洁一次。绿灯亮后，屏幕处于自动归零状态的0值时，将50 μL吸入的标准样品注入进样口。校准完成后，加入50 μL酶解液测定谷氨酸含量。测量结果示于图1。 2.随着酶解时间的延长，鳕鱼皮胶原酶水解液中谷氨酸的含量也逐渐升高。

[0012]步骤3：谷氨酸含量与水解度的回归分析。

[0013] 从图3可以看出，数据点基本落在一条直线附近。由此可见，变量X（谷氨酸含量）和Y（水解度）之间存在线性关系。但是由于不是所有的数据点都正好落在一条直线上，所以 X 和 Y 之间的关系并不是那么精确，以至于一个 Y 值可以由一个 X 值唯一确定，即实际测量值与实际测量值之间存在偏差。回归值。根据实验数据，得到回归方程y = 0. 7811X+5. 9172，是否通过相关系数检验(|r = 0.9658 >rmin = 0. 754)，F检验（F=69.46>F0.01（1，5)=16.26)或标准误差（0.251)（见表1、表3），都表明Y（谷氨酸含量）和Y（水解度）有非常显着的线性关系，证明由测定谷氨酸含量对预测被测酶解物的水解程度具有实际应用价值。

[0014]表1回归统计分析

[0015]

df SS MS F Fo.oid-5) 显着回归分析 1 4.37879482 4.378795 69. 459 16. 26 差异 5 0.31520518 0.063041 总计 6 4. 694

[0016]表2实验水解度与理论水解度的比较

[0017]

没有。测量值 预测值 Y 残差 1 7. 53 7.4794029 0.050597132 7. 99 8.2604936 -0.27049363 8. 66 8. 7291481 -0.06914814 9. 44 9. 0415844 0.39841561