甲醛溶液分析纯，国药集团化学试剂有限公司2.2试验仪器

甲醛溶液，分析纯，国药化学试剂有限公司

2.2 测试设备

仪器名称型号制造商

电子天平PL203梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司

pH计pHS-3C上海精密科学仪器有限公司

磁力搅拌器 84-1 上海美盈普仪器制造有限公司

手持式糖度计WYT-4 泉州中友光学仪器有限公司

超恒温水浴601上海森迪科学仪器设备有限公司

冰箱 BCD-204WE 上菱无霜冰箱和冰柜

CT15RT离心机，泰康

LC-MS 1000 江苏天瑞仪器有限公司

2.3 种测试方法

本实验中底物浓度为固液比（牛骨粉质量与水质量之比），酶添加量为底物质量百分比。

2.3.1 原料预处理

将购买的新鲜牛骨洗净、粉碎，然后在0.1MPa的条件下煮3小时，然后放入50℃的烤箱中烤6小时。用粉碎机粉碎后过筛，选择较细的骨粉冷冻保存，方便以后实验使用。

2.3.2 牛骨酶解液的制备

将牛骨粉从冰箱中取出，称重后放入酶反应器中，加入一定比例的去离子水，接上超恒温水浴，搅拌均匀。调节至最适pH，待酶解罐内温度恒定时水解度公式，加入适量酶制剂。酶解过程完成后，酶在100℃灭活8分钟，最后将酶解后的混合物4000r离心20分钟，取上清液，即为最终的酶解液。本实验的复合组合为：猪胰脂肪酶+木瓜蛋白酶（固定木瓜蛋白酶的条件不变水解度公式，猪胰脂肪酶的酶解条件分别优化）、一鸣脂肪酶+木瓜蛋白酶（固定木瓜蛋白酶的条件不同）变化，分别优化一鸣脂肪酶的酶解条件）、猪胰脂肪酶+木瓜蛋白酶（固定化猪胰脂肪酶为最佳酶解条件不变，优化木瓜蛋白酶的酶解条件）、猪胰脂肪酶+木瓜蛋白酶复合蛋白酶+伤寒蛋白酶（固定化猪胰脂肪酶和伤寒蛋白酶为最佳酶解条件不变，复合蛋白酶酶解条件进行了优化）。

2.3.3 水解度的测定-甲醛滴定

水解程度在一定程度上反映了酶解反应的程度[12]，因为当反应进行到一定阶段时，酶解反应的加剧主要使蛋白水解肽进一步转化为小肽和氨基酸，表现为水解度增加，但总氮回收率没有明显增加；同时，在反应的某一阶段，蛋白质水解生成多肽，总氮回收率较高。但由于游离氨基酸很少，水解度不会显示出很高的数值，所以本试验以水解度为指标来衡量水解度。

取10mL酶解上清+60mL蒸馏水→充分混匀→滴0.1mol/l氢氧化钠溶液至pH8.2→加10mL甲醛→使用0.1mol /l 氢气 将氧化钠溶液滴定至pH9.2→读取0.1mol/l氢氧化钠溶液的用量。

水解度是指水解肽键的百分比，公式如下：

(1)

其中：标准氢氧化钠溶液的C-浓度，mol/L；

V1－加入甲醛后样品稀释液滴定至终点所消耗的氢氧化钠标准溶液体积，mL；

V2－空白试验中加入甲醛至终点所消耗的氢氧化钠标准溶液体积，mL；

m——样品的质量，g；

V——酶解上清液体积，mL；

0.014 - 氮的毫摩尔质量，g/mmol。

8 - 每克蛋白质中肽键的毫摩尔数 (mmol/g)。

2.3.4 实验设计

实验前期，参考酶解文献[11-19]寻找猪胰脂肪酶、一鸣脂肪酶、木瓜蛋白酶、复合蛋白酶和风的最佳酶解温度、酶解时间和pH值蛋白酶。和酶剂量和底物浓度。为后续实验的优化提供参考数据。牛骨蛋白酶水解过程研究(3):