什么样的传感器可以检测HIV和化学修饰病毒疗法?(图)

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亮点：高度特异性的基于 RNA 的传感器可以区分点突变和 RNA 碱基修饰，并能够对大肠杆菌、人类样本和寨卡病毒株进行基因分型。

单核苷酸水平的遗传差异虽然很小，但可能是进化和发病机制的主要驱动因素，因为这些差异可能对基因表达、蛋白质折叠和 RNA 剪接产生广泛影响，并导致表型变化，这可能对耐药性和癌症的影响。例如，BRCA1 基因中的单核苷酸变异 (SNV) 使乳腺癌风险增加近 6 倍，而 HIV 中的点突变可导致一线抗逆转录病毒治疗失败。然而，传统的 HIV 耐药性检测每个样本的成本高达 200 美元，这使得许多人负担不起。因此，迫切需要一种廉价、即时、单核苷酸特异性的诊断技术来检测 HIV 和其他疾病的耐药性。

除了序列变化之外，RNA 转录物的化学修饰也会影响它们的细胞内作用。这种转录组修饰可以影响 RNA 寿命和二级结构，并影响细胞分化、翻译和疾病进展。因此，识别 RNA 分子内单核苷酸变化和化学修饰的分子探针是了解细胞生物学、挖掘细胞变异性、检测疾病和指导治疗决策的宝贵工具。然而，当没有昂贵的设备时，检测活细胞中如此细微的序列和化学变化以用于诊断目的是非常具有挑战性的。

核糖调节剂作为体内或护理点的高度特异性分子探针具有巨大潜力。主要优点是1）这些基于 RNA 的传感器具有编码、可预测、可控的碱基相互作用，可以报告它们在有或没有细胞的系统中的状态。核糖调节剂还可以直接与它们的靶 RNA 结合，而无需中间蛋白的帮助，这一特性使它们在遗传上紧凑且易于实施。十多年来，基于自然系统、自动化设计程序和从头设计原则开发了各种不同的核糖调节剂。这些系统具有低串扰的类蛋白质动力学，并已用于检测内源性转录本并应用于体内执行多输入逻辑操作。 2）低成本。它们可以与用于诊断的无细胞转录翻译反应相结合，每次测试的材料成本仅为 3 美元。

然而，它的局限性在于，1）核糖调节剂的特异性还不足以解决序列中的单核苷酸差异，因为具有单点突变的靶转录物会产生微小的杂交自由能，这很难检测； 2）单核苷酸多态性 (SNP) 测定通常与高温活细胞和无细胞系统不兼容。 3) 现有的通过体外测量开发的 RNA 杂交模型可能无法捕获复杂细胞内或无细胞环境中的 RNA 行为，从而阻碍了核糖调节剂的开发。

近日，来自美国亚利桑那州立大学的方宏在 Cell 上发表文章《Precise and Programmable Detection of Mutations Using Ultraspecific Riboregulators》，开发了一种从头设计的核糖调节器来解决上述限制，称为monucleoside Acid-specific可编程核糖调节剂 (SNIPR) 的主要优点是能够在体外区分原核细胞转录物中的单碱基变化和无细胞系统中的单官能团变化。这些超特异性核糖调节蛋白可以完美匹配靶序列RNA来翻译靶基因。如果目标 RNA 有一个单核苷酸变化，则序列差异会导致显着的热力学损失，从而阻止 SNIPR 激活。如果目标 RNA 是单碱基替换或插入和删除，则会导致接近背景的表达水平。在体外系统中，正确的靶标和具有单个核苷酸差异的靶标之间的输出存在一百倍的差异，这很容易检测到。

研究人员进一步证明，SNIPR 还可以区分具有单个甲基修饰的 RNA。为了证明超特异性核糖调节剂的效用，他们将 SNIPRs 与温度稳定的纸基无细胞系统相结合，以检测耐药突变，例如疟疾的青蒿素耐药形式和 HIV 耐药形式，并导致囊性纤维化和血色素沉着症的突变。将基于纸张的 SNIPR 平台与等温扩增相结合，可以检测临床血液样本的致癌突变，并在比色反应中进行视觉识别以识别病毒。因此，SNIPRs是特异而强大的分子探针，具有从基础细胞生物学研究到精确和个性化疾病检测和诊断的潜在应用。

虽然 SNIPR 具有出色的性能和可编程性，但它们的识别能力和目标定位受到多个因素的限制。首先，现有的热力学模型和参数并不总是足以预测 SNIPR 性能。尽管这些工具通常是有效的，但确实存在多个类型参数无法预测 SNIPR 功能的实例，导致每个临床目标通常筛选许多 SNIPR。这种不确定性通常归因于设计过程中使用的 RNA 能量参数。这些参数用于预测靶-SNIPR的相互作用以及RBS的二级结构、起始密码子和基因的早期部分，这些都会影响翻译效率。

本研究的能量参数没有考虑可能改变 SNIPR 平衡的非规范三级相互作用，例如在水中的 1M NaCl 中测量的，这种环境比细胞质或无细胞反应复杂得多，如无细胞转录-翻译系统包含多种离子物质，以确保重构的细胞机器正常运行，包括乙酸镁、磷酸钾、谷氨酸钾、氯化铵和氯化钙。其他化学辅助因子的多样性和所需蛋白质建立的拥挤条件进一步使反应环境复杂化。这种环境很难预测 RNA 折叠的动力学和热力学，需要进一步研究。

教授介绍

博士。 Alexander Green 是亚利桑那州立大学分子设计与仿生设计中心和分子科学学院的助理教授。他于 2005 年毕业于多伦多大学，获得工程科学学位，并获得博士学位。 2010年获得西北大学材料科学与工程专业博士学位。之后，格林博士在哈佛大学威斯研究所从事博士后研究。

Green 博士的研究领域涵盖从合成生物学到自组装再到碳纳米材料，在柔性电子、能源和低成本诊断等领域都有应用。 Green 博士是计算和进化分子生物学领域的 Alfred P. Sloan 研究员 (2017），并获得 NIH 新创新奖 (2017）、DARPA 青年教师奖 (2017）@) >点突变试剂盒，DARPA青年教师主任奖学金（2019年），亚利桑那州生物医学研究委员会新研究者奖（2017年）。发表同行评审论文60余篇，被引用8500多次，其中7篇发表在Cell上， Nature、Nature Nanotechnology 和 NatureChemistry。Green 博士拥有 5 项授权专利和 17 项临时专利。自 2015 年以来，他作为 ASU 的独立研究员获得了超过 400 万美元的外部资助。

参考文献

1. 范宏、马多、吴凯悦等。使用超特异性 Riboregulators 对突变进行精确和可编程的检测。 180,1018-1032 号牢房点突变试剂盒，202 年 3 月 5 日0.

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