愈创木酚遇三氯化铁变为蓝色的制备方法与制备

愈创木酚（或愈创木酚，以原产于拉丁美洲的愈创木酚树命名）是一种天然有机化合物，分子式为C6H4(OH)(OCH3)。这种无色芳香油状化合物是杂酚油的主要成分，可由愈创木脂、松油等制成。常见的愈创木酚因暴露在空气或光线下而呈黑色。由于木材熏木分解，燃烧木材产生的烟雾中含有愈创木酚。许多食物由于有特殊气味愈创木酚的存在，如烘焙咖啡豆。熏制食品的特殊风味主要是愈创木酚和丁香酚。影响。愈创木酚在氯化铁存在下变蓝。GB 2760-96规定暂时允许使用食用香精. 主要用于制备咖啡、香草、香烟烟雾和烟草等香精。

愈创木酚

IUPAC名称：2-甲氧基苯酚

别名：邻甲氧基苯酚；儿茶酚甲醚

化学性质：白色或微黄色结晶或无色至淡黄色透明油状液体。有特殊的芳香气味。微溶于水和苯。溶于甘油。与乙醇、乙醚、氯仿、油类和冰醋酸混溶。气味阈值：0.0074ppm。

识别

CAS号

90-05-1

联邦应急管理局

2532

PubChem

460

化学蜘蛛

447

自然

化学式

C7H8O2

摩尔质量

124.14g/mol·g·mol⁻¹

密度

液体1.112 g/cm3

固态1.129 g/cm3

熔点

28°C (301K)

沸点

204-206°C

除非另有说明，所有数据均在正常条件下（25 ℃，100 kPa）。

准备

在自然界中，愈创木酚存在于愈创木脂或松油中。在木材干馏得到的杂酚油中，愈创木酚是主要成分，可通过分馏杂酚油得到。日本大阪炼化株式会社以邻硝基氯苯为原料，制成邻硝基苯甲醚，再还原为邻苯甲醚，最终得到产品。我们的制作方法大致相同。原料消耗定额：含氨基苯甲醚1250kg/t、硫酸（93%）1500kg/t、亚硝酸钠700kg/t、硫酸铜400kg/t。在工业上，愈创木酚通常由氢儿茶酚甲基化产生。例如碳酸钾与硫酸二甲酯和儿茶酚反应：

C6H4(OH)2+ (CH3O)2SO2 → C6H4(OH)(OCH3) + HO(CH3O)SO2

愈创木酚也可以通过干馏木材制成的杂酚油的混合物形式获得。

实验室准备

愈创木酚可用于多种实验室方法。例如，以邻硝基氯苯为原料，采用Williamson合成法合成邻硝基苯甲醚，再将硝基还原为氨基，最后通过重氮化水解反应合成最终目标产物中国和日本公司也利用这条路线工业化生产愈创木酚。另一种合成愈创木酚的方法是甲基化邻苯二酚，然后选择性部分水解：

C6H4(OCH3)2+ C2H5SNa → C6H4(OCH3)(ONa) + C2H5SCH3

有毒

LD50 900 mg/kg（大鼠，皮下）。 LD50 3.7mg/kg（兔，静脉注射）。大量口服可刺激食道和胃，导致心肌衰竭、虚脱和死亡。

有限使用

FEMA (mg/kg)：软饮料0.95；冷饮0.52；糖果0.96;烘焙食品0.75.中度受限（FDA §172.515, 200 0).

目的

愈创木酚广泛用于工业。愈创木酚通常用于生产丁香酚、香兰素和人造麝香等各种香料。愈创木酚也广泛用于医药。它可用于合成愈创木酚苯磺酸盐（愈创木酚磺酸钾），用作局部麻醉剂或防腐剂，用作祛痰剂和治疗消化不良。由于具有还原性，在化妆品中常作为抗氧化剂少量添加，常与增效剂、金属离子螯合剂等配合使用。愈创木酚也可用作染料，因为它与氧气反应产生深色颜色。愈创木酚还用作有机合成的原料和分析测定的标准物质。

相关化合物

愈创木酚和甘油形成的醚（愈创甘油醚）是一种常用的祛痰剂，也被称为金葱糖浆或止咳糖浆。愈创木酚的另一种衍生物邻苯二甲酸酯（又称白藜芦醇或藜芦醇）也是一种常用的化工产品。

安全

愈创木酚可用作吸入烟雾的指标，因为从食物中摄取的愈创木酚量远大于通过呼吸吸入的烟雾中的愈创木酚量。

愈创木酚的生物合成

1、结合转录组和蛋白质组分析探讨酸环酸杆菌生产愈创木酚的机制

脂环酸杆菌属。可能导致商业巴氏杀菌果汁/饮料变质，其特征是由于愈创木酚产生独特的药用或防腐剂异味。本研究旨在结合转录组学和蛋白质组学方法，揭示酸土脂环酸杆菌产生愈创木酚的机制。通过 RNA 测序和 iTRAQ 分析研究了生产（使用 500 μM 香草酸）和不生产（没有香草酸）愈创木酚之间的基因和蛋白质表达水平的差异。共鉴定出225个差异表达基因和77个差异表达蛋白。编码香草酸脱羧酶亚基的基因 vdcBCD 的转录分别上调 626.47、185.01 和 52.81 倍；它们是愈创木酚生产中上调最多的基因。苯甲酸盐膜转运蛋白、镰刀酸抗性蛋白、抗性结节切割转运蛋白、一些 ATP 结合盒转运蛋白和主要促进子超家族转运蛋白的表达在 mRNA、蛋白质或两者水平上均有所增加。表明它们参与了香草酸的吸收和愈创木酚的合成。在酸脂酸杆菌从香草酸合成愈创木酚的代谢过程中，三羧酸循环途径和核糖体相关基因的表达上调，而缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成则相关基因表达降低。这些发现为了解愈创木酚的产生机理提供了新思路，也为果汁行业愈创木酚的防控提供了重要指导。

图1 愈创木酚生物合成示意图[1]

愈创木酚在香精工业中的应用

天然香草香料的鉴定：香草醛至愈创木酚的同位素表征[2]

本文将香兰素的同位素研究延伸至近年来发现的天然香兰素前体的新来源，以期通过生物技术方法获得天然香兰素。为了检查香草醛的同位素组成与相应的芳香片段的一致性，进行了愈创木酚的选择性降解反应。实验表明，该反应可以在没有明显同位素分馏的情况下进行，并且从包括试剂量、温度和实验时间在内的实验设计结果中确定了优化的工艺。愈创木酚是一种有趣的碳氧同位素比质谱 (IRMS) 同位素探针。它提供了芳香族片段特异性的(13)C信息，结合香草醛本身测得的(13)C值，提高了碳-IRMS的识别潜力。因此，阿魏酸的自然状态可以其特点是在甲酰基位消耗大量 C。同样，愈创木酚的氧 18 含量是比香兰素的 δ(18)O 更好的识别工具，因为在工业或实验室程序中，它是不受 sp(2) 氧原子与水的化学交换而改变的缺点。尽管仍需要合作研究以改进 delta(18)O 参数的实验, 但在实验室内可以得到一致的结果。特别是阿魏酸的化学氧化，其特征是香兰素芳香部分的相对富集。

图2香兰素的三种来源

图3 香兰素前体分子结构：1a, R) CH3 (isoeugenol); 1b，R)COOH(阿魏酸)； 1c，R）COCH2R'（姜黄素）。 1a-c如图4所示。

已经对香草的鉴定进行了大量研究，从香草豆中提取的天然产品被认为比其合成或半合成的同类产品具有更高的价值。通过同位素比质谱 (IRMS) 和核磁共振 (SNF-NMR) 进行的稳定同位素分析为区分香草豆与其他两种重要来源愈创木酚和木质素提供了一个非常强大的工具（图 2)。对香草香精的需求增加和天然香草豆提取物的相对短缺，导致了市场上主要的香精香料成分香草醛的新来源的开发。这些来源主要是以前的来源，仍然来自天然产品。其分子结构如图 3 所示，R)-CH3（异丁香酚，1a，来自丁香酚的丁香油），R) 羧基（阿魏酸，1b，来自米糠或甜菜浆），或 R) CO- CH2-R”（姜黄素，1 c，来自姜科的根）。源自这些分子的香草醛涉及侧双键的氧化裂解（图。4).

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图 4 从阿魏酸、姜黄素或异丁香酚中提取香草醛的新来源。

图5 香兰素降解为愈创木酚

所以身份验证问题是双重的。首先，需要验证前体的天然状态，其次，必须保证前体转化为香兰素，无需任何化学步骤。先前的研究已经确定是否由于非法操纵香草醛分子而导致甲酰基或甲氧基的任何不寻常的 13C 或 2H 富集发生。最近，还提出了香草醛的氧同位素比 δ18O 作为区分天然样品与愈创木酚和木质素来源的有效附加参数。然而，香草醛甲酰基的氧原子在任何制备和纯化步骤中都容易与水发生化学交换。因此，有必要开发一种新的工具来克服 18O 程序的这个缺点，而香兰素降解为愈创木酚被认为是没有这个缺点的。鉴于需要鉴定标准丁香酚法制备香兰素，包括香兰素的新生物技术来源，这项工作还旨在根据碳和氧同位素数据确定不同前体香兰素样品的置信区域，并研究氧化裂解产生的分子的同位素参数影响. （香兰素转化为愈创木酚的研究。该反应涉及苯甲酰基键与钯的催化裂解（图 4)）。在配备冷凝器的 250 ml 圆底烧瓶中丁香酚法制备香兰素，注入等量的适量香草醛（至少 200 毫克）和 1% w/w 钯沉积在活性炭上。用手搅拌混合物并在 210°C 的油浴中回流 2 小时。然后将混合物冷却至室温30分钟，所得愈创木酚溶解在30-40毫升二氯甲烷中。然后在真空下，通过熔块玻璃漏斗（编号4.））

碳同位素比。对于来自天然前体（豆类、阿魏酸、木质素和异丁香酚）的香草醛，愈创木酚分子在 13C 中略微富集（样品 1b 除外）。计算的平均值为1.3‰。相比之下，化石前体略有减少（≈-1‰）。这种行为表明，在合成产品中，香兰素的甲酰基相对于来自天然来源的相同片段富含 13C。这一观察结果与氢同位素参数的典型行为一致，与用于合成香草醛的乙醛酸的高 13C 含量（~-20‰）一致。与 Krueger 和 Nicol 的结果一致。虽然公式1计算的δ13C(CHO)值精度有限，但可以得出结论，香草醛从非天然阿魏酸中失去了特别高的甲酰基（样品4和6a-c的δ13C值在-38‰和- 67‰)。这些结果有力地支持了从天然阿魏酸中提取的香草醛的δ13C值（平均δ13C值-36.9‰，样品4和样品6a-c）来确定其自然状态。此外，香草醛前体天然阿魏酸（δ13C）-34.4‰样品4和6a-c）和米糠阿魏酸（δ13C）-35.5‰样品13C含量的平均值很相似。

氧同位素比。在实践中，氧同位素比率在认证过程中并不重要。如上一节所述，实验室间重现性水平低使绝对值的比较复杂化，结果通常必须在相对基础上进行解释。此外，必须考虑由于氧交换而丧失选择性的风险。因此，就香兰素而言，在样品提取和制备过程中，sp2 氧原子很可能与水发生交换，香兰素本身并不是 18O-IRMS 的方便通用探针。原则上，从香草醛中提取的愈创木酚更好地规避了交换的风险。此外，其δ18O值仅为两个以上位置的平均值，显示出较高的选择性。也可以确定更多的选择性参数，但代价是进一步的香草醛降解反应。弗龙扎等人。最近公布了三种前体的选择性 δ18O 值：香草豆、木质素和愈创木酚。结果表明，氧同位素分析提供了有关这三个氧原子起源的有趣机制信息。根据表 3 中的结果，可以评估愈创木酚作为 18O-IRMS 探针在合理时间内表征整个天然、化学和生物技术来源的鉴定潜力。结果表明，合成和半合成香兰素直接测定的18O含量（δ18O）为8.9‰，样品2a、b和3a-c），而从大豆或天然前体香兰素中提取的18O含量（δ18O）为8.9‰。 (δ18O) 为 14.1‰，样品 1a,b,4、6a c 和 7a,b)。这种差异可能与前体的具体性质无关，而是与提取过程的工业或实验室性质有关，因为样品 2 和 3 是商业工业产品，而其他样品是在实验室规模上制备和提取的。在严格标准化的条件下获得的愈创木酚有望提供一种氧同位素探针，它代表唯一的不可交换原子，因此对样品处理的依赖性较小。虽然δ18O的变化范围相当有限，但可以得出结论，阿魏酸双键的化学氧化导致香草醛的δ18O值比水溶液中的酶促反应略有增加。

鉴于香兰素的经济重要性和新生物技术来源的引入，人们继续对开发鉴定标准感兴趣。当提取足够数量的样品时，SNIF-NMR 方法对于区分香兰素的主要来源特别有效。然而，面对日益复杂的欺诈和调查稀释介质的需要，碳和氧同位素比率也可以使用内部质谱仪确定。这项研究的结果扩展了以前的研究，表明在可重现的同位素条件下从香草醛制备愈创木酚为确定不受甲酰氧交换影响的碳氧同位素比提供了新的探针。干涉。将愈创木酚结果与香兰素同位素比的测定相结合，还可得到甲酰基同位素含量的信息。结果表明，所建立的香兰素降解为愈创木酚的实验方法可靠、准确。结果表明，愈创木酚的δ13C值与香草醛的δ13C值的均方偏差（MSD）为1.77，说明愈创木酚是鉴别香草醛前体的良好补充指标。

愈创木酚的药理活性

1、抗氧化剂愈创木酚对禾谷镰刀菌的生长和脱氧雪腐镰刀菌烯醇的产生具有杀菌和抑制作用

从干木中蒸馏出来的杂酚油的主要成分是愈创木酚，一种广泛用于医药和食品保鲜的天然抗氧化剂。然而，愈创木酚的抗真菌机制尚不清楚。本研究发现愈创木酚对禾谷镰刀菌的菌丝体生长、分生孢子的形成和萌发以及脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）的生物合成具有剂量依赖性的抑制作用。愈创木酚对标准菌株PH-1的中位有效浓度（EC50)值为1.838 mM。愈创木酚对孢子的产生和萌发有很强的抑制作用。愈创木酚的抗真菌作用可能是与其破坏 Ca2+ 转运通道的能力有关。此外，愈创木酚处理降低了丙二醛 (MDA) 水平，降低了过氧化氢酶 (CAT)、过氧化物酶 (POD) 和超氧化物歧化酶 (SOD) 的活性，表明愈创木酚抑制霉菌毒素的产生脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）通过调节氧化反应。氧化剂对禾谷镰刀菌真菌毒素的抑制作用。

图 6 愈创木酚抑制禾谷镰刀菌菌丝体的生长。 (A) 菌株 PH-1 在含有愈创木酚 (0-6.4 mM) 的 PDA 平板上培养 3 d，拍照并测量菌落直径； (B)愈创木酚(0-16 mM))处理禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum, PH-1) SEM观察菌丝形态[3]

不同浓度的愈创木酚处理禾谷镰刀菌 PH-1，愈创木酚以剂量依赖性方式抑制菌丝生长，而 6.4 mM 愈创木酚完全抑制菌丝生长（图 6A）。愈创木酚对 PH-1 的 EC50 值为 1.838 mM。此外，通过扫描电镜（SEM）检测愈创木酚对禾谷镰刀菌菌丝生长的影响，可以清楚地看到愈创木酚处理后菌丝形态发生了变化。与常规平滑对照菌丝不同，16 mM愈创木酚处理后菌丝明显塌陷（图6B）。

2、漆酶催化合成愈创木酚低聚物抗菌粉体

以漆酶为催化剂，通过酶催化聚合制备愈创木酚低聚物。 UV-Vis光谱反应在水溶液中进行。通过NMR和MALDI-TOF光谱对其进行表征。紫外-可见光谱观察显示在380~530 nm范围内形成了一个新峰，表明新物种的形成。 NMR结果表明酚羟基参与了聚合反应。 MALDI-TOF光谱表明愈创木酚低聚物的质均聚合度为10，重复单元的质量为122。通过热重分析（TGA/DSC）研究了热稳定性。愈创木酚低聚物的热稳定性优于愈创木酚，这可能与愈创木酚的共轭π链较长有关。 ABTS 自由基点+自由基的抗氧化活性呈浓度依赖性，在 800 μg/mL 时达到平台期。所得愈创木酚低聚物对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌具有一定的抑菌活性，抑菌率达99%。

图7 愈创木酚低聚物合成示意图[4]

3、愈创木酚通过阻断RANK与TRAF6和C-Src的相互作用，抑制NF-κB、MAPK和AKT信号通路来抑制破骨细胞的形成

当归是一种传统中药，数百年来一直用于治疗骨质疏松症和骨坏死等骨病。然而，其活性成分和作用机制仍不清楚。愈创木酚通过二维细胞膜色谱/C18柱/飞行时间质谱（2D CMC/C18柱/TOFMS）鉴定为当归的有效成分。愈创木酚在体外以剂量依赖性方式抑制骨髓单个核细胞（BMMCs）和RAW264.7细胞的破骨细胞生成和破骨细胞功能。共免疫沉淀表明愈创木酚阻断了 RANK-TRAF6 和 RANK-C-Src 的结合。愈创木酚可抑制 p65、p50、IκB（NF-κB 途径）、ERK、JNK、c-fos、p38（MAPK 途径）和 Akt（Akt 途径）的磷酸化，降低表达水平组织蛋白酶 K、CTR、MMP-9 和 TRAP。愈创木酚还抑制活化 T 细胞胞质核因子 1（NFATc1) 和 rankl 诱导的 Ca 变化。在体内，它通过抑制过度破骨细胞生成来改善卵巢切除术引起的骨丢失。总之，愈创木酚抑制 rankl-通过阻断 RANK 与 TRAF6 和 C-Src 的相互作用，以及抑制 NF-κB、MAPK 和 AKT 信号通路诱导破骨细胞生成。显示出治疗破骨细胞生成相关的骨疾病，包括绝经后骨质疏松症的潜力。

图 8 愈创木酚提取自 AS。 A. 2D CMC/C18 色谱柱/TOFMS 系统。 B，愈创木酚的典型二维色谱仪。 C.愈创木酚分子式[5]

通过二维BMMC/CMC/C18柱/TOFMS分析，愈创木酚被鉴定为as的活性成分，在体外发现愈创木酚具有明显的破骨细胞功能和对破骨细胞生成的抑制作用。通过阻断 RANKL/m-csf 和 C-Src 之间的相互作用，RANKL/m-csf 诱导的 NF-κB、MAPK 和 AKT 信号通路的激活在早期被降低。在体内，它显着减轻了 ovx 引起的骨丢失（图 9)。

图9 愈创木酚通过多种信号通路抑制破骨细胞分化及功能的机制[5]

4、酮洛芬和天然抗氧化剂（百里酚、薄荷醇和愈创木酚）的新衍生物的设计和合成，它们可能是彼此的前药

非甾体抗炎药 (NSAID) 是使用最广泛的一类药物。主要用于治疗骨关节炎、类风湿性关节炎等炎症性疾病。然而，非甾体抗炎药的使用受到限制，因为它可能在胃肠道中诱发糜烂和溃疡。近年来，活性氧（ROS）的局部产生在与非甾体抗炎药治疗相关的胃溃疡形成中发挥了重要作用。因此，在本研究中，一种非甾体抗炎药（酮洛芬）与具有抗溃疡活性的不同抗氧化剂（百里酚、薄荷醇和愈创木酚）联合使用。目的是获得酮洛芬-抗氧化衍生物的共同前药，包括：酮洛芬-百里酚(化合物I)、酮洛芬-薄荷醇(化合物II)和酮洛芬愈创木酚(化合物III)。非甾体抗炎药和抗氧化剂的互惠前药被指定为单一化学实体，以产生互补的药理作用，改善抗炎作用，减少溃疡的副作用。合成方法经FT-IR、CHNS和理化性质证实。 [6]

参考文献

[1] ZhouliWang，Yunhao Liang，Qi Wang，Hang Jia，Tianli Yue，Yahong Yuan，Zhenpeng Gao，Rui Cai，转录组和蛋白质组的综合分析探索酸土脂环酸产生愈创木酚的机制，FoodResearch International，2021， 148,110621,doi.10.1016/j.foodres.2021.110621.

[2] Bensaid、Fatiha 和 Wietzerbin、Karine 和 Martin、Gérard。 （2002)。天然香草香料的鉴定：利用香草醛降解为愈创木酚的同位素表征。农业和食品化学杂志。50.6271-5.10.1021 /jf020316l.

[3] 高涛、张尧、施建荣、穆罕默德·谢里夫·拉姆齐、徐建宏、刘欣。抗氧化剂愈创木酚对禾谷镰刀菌的真菌生长和脱氧雪腐镰刀菌烯醇产生具有杀菌活性。微生物学前沿,2021, 12, DOI.10.3389/fmicb.2021.762844

[4] NannanLi, Jing Su, Hongbo Wang, Artur Cavaco-Paulo, 通过漆酶催化合成反应生产愈创木酚低聚物抗菌粉末, 过程生物化学, 2021, 111, Part 1, 213-220, doi. 1 0.1016/j.procbio.2021.07.018.

[5] 辛志、方超、顾艳秋、陈慧文、陈晓飞、崔金、晏虎、翁伟宗、周其荣、王亚军、王耀、姜浩、李晓群、曹烈虎、小陈、苏家灿愈创木酚通过阻断 RANK 与 TRAF6 和 C-Src 的相互作用并抑制 NF-κB、MAPK 和 AKT 通路来抑制破骨细胞生成。细胞与分子医学杂志, 2020, 24(9): 5122-5134.

[6]Shaheed, D.Q., Kareem, A., Mubarak,H., Abdul, A., Abbas, H.K. 和 Dakhil, M.A. (2015). 酮洛芬新衍生物的设计和合成与天然抗氧化剂（百里酚、薄荷醇和愈创木酚）作为可能的共同药物。