底物亲和法分离纯化及鉴定胃蛋白酶实验原理和步骤实验方法

底物亲和法分离纯化鉴定胃蛋白酶

目的：

1.学习和掌握底物亲和法分离纯化蛋白质的实验原理和操作步骤；

2.回顾和巩固SDS聚丙烯酰胺磷凝胶电泳分离蛋白质；

3.学习掌握DEAE离子交换色谱的实验原理和步骤

实验原理：

现有研究结果表明，动物源性胃蛋白酶比微生物源性蛋白酶具有更高的活性，其中许多已被用于食品和药物中，以缓解胃分泌功能障碍患者的疼痛。动物胃蛋白酶是一种优质酸性蛋白酶，可为转基因蛋白酶的开发提供基因活性更高的酶，而转基因蛋白酶是一种环保高效的饲料添加剂，在畜牧业中将具有巨大的应用前景。

本实验采用“底物亲和法”纯化胃蛋白酶。方法是利用底物与酶的特异性结合，将液体体系中的复合蛋白和胃蛋白酶复合物分离，然后加入低浓度的SDS，将复合蛋白和蛋白酶分离。纯化得到电泳胃蛋白酶。

实验材料和仪器：

新鲜兔胃肠组织；复合蛋白；L-酪氨酸；小分子量标准蛋白；高速冷冻离心机Avanti-J-25I；PHS-10A数字酸度和离子计；组织捣碎器；分光光度计；电泳仪等。

实验方法：

一。硫酸铵分级沉降蛋白酶

1.取兔子的胃肠组织（111.9g），用蒸馏水清洗，加入400ml 0.1M pH7.3磷酸盐缓冲液

冲洗液体并用高速组织捣碎机捣碎，转速为 2000 rpm，每次 10 s。

2.重复步骤 1 十二次。

3.4℃提取24h，提取液4℃10000rpm离心15min，保留上清，同时沉下

将沉淀用缓冲液重新溶解10%三氯乙酸，提取、离心并弃去，将提取上清液混合两次。

4.上清液有20%（NH4）2SO4盐析，充分沉淀后，12000rpm离心10min，取

血清

5.上清液中加入60%饱和（NH4）2SO4盐析，12000rpm离心去除上清液，

将所得沉淀溶解于等体积的0.05mol/L pH7.3磷酸盐缓冲液中，得到酶原粗提物

液体。此条件由 10%-80% (NH4）2SO4 分级盐析决定。

6.酶原活化：将粗酶原提取液的pH值调节至2.5，酶原会自动转化为活性胃蛋白酶

酶。

二。络合蛋白-胃蛋白酶底物亲和力

1.亲和条件的确定

1.酶原粗提液用0.45um滤膜过滤，加入硅藻土助。

2.滤液和2%复合蛋白分别为1:1、5:1、10:1、15:1、1:5、1 : 10、1:15 比例

例拌匀，37℃恒温水浴10min。

3.用2mol/L氨水调节pH

4.0，让复合蛋白沉淀，10000rpm 5min，保留上清，沉淀

溶解在 10ml 0.05mol/L 乳酸缓冲液 pH2.5 中。去除上清液并沉淀裂解物以获得酶活性

测定以确定最佳底物浓度比。

2.SDS 沉淀的复合蛋白

4.络合蛋白-胃蛋白酶复合物中加入10、20、30、40、50、60ul 10mmol/L

SDS，混合均匀，4°C 放置 60 分钟。

5. 10000rpm离心5min，取上清液，在280nm处测定吸光度，测定上清液的酶活性。3.DEAE 离子交换纯化胃蛋白酶

6.将 SDS 沉淀的上清液装入预平衡的 0.05mol/L 醋酸盐缓冲液（pH 5.0）

在 DETE-TOYOPEARL 离子交换色谱柱 (4.6mm*100mm) 上，使用 0.00-0.25mol/L NaCl 梯度洗脱，流速为 1ml/min。

7.用馏分收集器收集洗脱液，1管/5min，测定每管OD280的酶活，相应吸取蛋白

含量和酶活性曲线。

4.胃蛋白酶活性的测定

8.取样品1.0ml，加入预热的2%络合物溶液（预热0.05mol/L，pH2.5乳酸缓冲液）

剂）1.0ml，37℃恒温水浴10min。

9.加入三氯乙酸2.0ml，摇匀，静置2min，用滤纸过滤。去考虑上清液1.0ml，加

加入Na2CO3溶液5.0ml，福林试剂1.0ml，充分摇匀20min，在660nm处测定吸光度。

10.用100ug/ml标准酪氨酸溶液绘制标准曲线。

5.蛋白质特性鉴定

11.蛋白质浓度和纯度的测定：用福林苯酚试剂测定蛋白质浓度。SDS-PAGE电泳

请按照以下方式进行：

一、组装模具：

用海绵蘸取少量清洁剂，擦洗两块玻璃板，用自来水冲洗3-5次，再用无水乙醇冲洗2次，晾干备用。用密封件密封两个清洁的玻璃板。

将浅玻璃板朝外（靠近操作者一侧）组装在电泳架上，然后固定牢固。（注意：清洁玻璃板时要轻柔，不要划伤玻璃表面；清洁后，不要用手触摸玻璃表面。）

二、制作胶水：

1、用10ml 10%的分离胶：吸出溶液A3.3ml，溶液B2.5ml，蒸馏水4.2ml，D

在小烧杯中加入 100 μl E 溶液，再加入 10 μl E 溶液，立即混合，用 10 ml 注射器吸取约 8 ml 混合溶液，沿玻璃板间隙的左上方，缓慢倒入胶水，直到它远离前玻璃板的边缘。1.5 厘米。（注：A、当凝胶完全浸没在玻璃板底部时，注意观察是否有漏胶现象。如果漏胶，应立即停止灌胶，重新固定模具后再继续。B灌胶要缓慢进行，以免产生气泡）

2、水膜密封空气：在分离胶上小心加一层蒸馏水，隔绝空气，促进

成凝胶聚合。等待20-30min左右，界面有明显的折射线，模具倾斜，界面不随其变化，凝胶固化良好。用滤纸小心地洗干。

3、用5%浓缩凝胶5ml：吸出溶液A0.67ml，溶液C1.0ml10%三氯乙酸，蒸馏水2.3ml，D

加入50μl液体E溶液，在小烧杯中摇匀，加入5μl E溶液，立即混合，倒胶，到达前玻璃板边缘。

4、插入齿梳，确保没有气泡。等待凝胶完全聚合，大约 30 分钟。

5、 小心拉出梳子，取下封条，将玻璃倒置，浅玻璃面向

电泳架上。将整个电泳架放入电泳槽中，将电泳缓冲液倒入内外槽中，内槽液面应在前后玻璃板之间。

三、采样：

1、 吸取 20μl 蛋白样品到 EP 管中，加入 4μl 上样缓冲液，混匀，烧开水

加热5分钟

2、加载整个样本，注意不要让样本漂移。

3、同时移取蛋白Marker10—20μl进行点样。

四、电泳：连接正负极引线，将电压稳定在120V，直到溴酚蓝到达分离胶底部。

五、染色：

1、剥胶

2、将凝胶仔细浸泡在考马斯亮蓝染色液中，45℃摇动30分钟。

3、脱色：将凝胶浸泡在考马斯亮蓝脱色液中，放一小块海绵，45℃摇匀

振床4-8h，期间更换脱色液3-4次，观察蛋白电泳情况。

12.酶最适pH和温度的确定：最适pH的确定：分别使用0.5mol/L盐酸和2mol/L氨水

将络合剂溶液的 pH 值调整为 1.0、2。0、3.0、4.0、5.0、6.0、7. 0、8.0; 最佳温度

在0.05mol/L，pH2.5乳酸缓冲液，温度范围25℃--70℃，孵育30min后测得

决心。

实验的预期结果：

1.粗胃蛋白酶溶液硫酸铵分级沉淀

可从下表得出：当硫酸铵饱和度为20%时，大部分胃蛋白酶仍溶解在溶液中。

当饱和度达到60%时，大部分胃蛋白酶沉淀。因此样品的盐析硫酸铵是饱和的

度数为20%-60%。

2. 亲和力条件的确定

由下表得出：单位粗酶样品溶液：复合蛋白的体积比为5：1时，最佳组合，分离纯

最好的效果。本实验采用5:1的比例进行实验。

3.SDS 沉淀的复合蛋白

从图中可以看出，如果要追求好的纯度，可以选择蛋白质含量最小的条件：30ul 10mmol/L SDS溶液