色谱纯乙腈密度 1.本发明属于检测技术领域的涉及一种化妆品的检测方法

1.本发明属于检测技术领域，具体涉及一种化妆品或其原料中添加剂的检测方法。

背景技术：

2.随着化妆品配方的发展和技术的不断进步，各种功能性化妆品和原料被广泛使用，产品的相容性下降。产品的引入和残留物质都是影响产品安全的因素。视黄醇是近年来新兴的抗痘、抗皱原料，包括视黄醇、视黄酸、视黄醛和视黄酯等。这些物质可以改善上皮细胞的异常角化和皮脂排泄。抗痤疮和抗皱药物。虽然视黄醇是人体必需的活性物质，在体内转化为视黄酸，但过量摄入会导致肝肿大、钙流失和致畸。维甲酸和异维甲酸具有高度刺激性、致畸和胚胎毒性。它们只能用作处方药，是化妆品中的禁用成分。研究表明，这些衍生物只有在体内转化为维甲酸后才能起到改善衰老的作用。在可预见的使用环境下，视黄醇与其他化妆品基材相互作用，会转化为视黄酸。酸或其他未知化合物，此类原料的风险评估将侧重于转化产物对毒性结果的影响。

3.视黄醇、视黄醛和视黄酯是化妆品中常用的抗皱抗衰老成分。类视黄醇物质。文献报道的维生素A衍生物的检测方法主要针对食品，而化妆品中的检测方法仅包括维甲酸、视黄醇等极少数衍生物的检测方法。

技术实现要素：

4.为了克服现有技术中存在的上述问题，本发明的目的在于提供一种化妆品中添加剂或其原料的检测方法。

5.为了达到上述目的，本发明采用的技术方案是：一种化妆品或其原料中添加剂的检测方法，包括以下步骤：采用高效液相色谱法检测化妆品或化妆品原料在待测液体中进行测试，添加剂包括视黄酸、异维甲酸、羟基频哪酮视黄酸酯、视黄醛、视黄醇乙酸酯、视黄醇棕榈酸酯、视黄醇、视黄醇丙酸酯、视黄醇视黄酸酯中的至少一种.

6.优选地，所述添加剂包括视黄酸、异视黄酸、羟基频哪酮视黄酸酯、视黄醛、视黄醇乙酸酯、视黄酸黄乙烯基棕榈酸酯、视黄醇、视黄醇丙酸酯、视黄醇视黄酸酯。

7.优选色谱条件为：色谱柱为：c18色谱柱；进样量为：4-6 μl；流速为：0.8-1.2ml/min；流动相：流动相a为乙腈；流动相b为四氢呋喃；流动相c为醋酸铵溶液，梯度洗脱。

8.优选进样量为：4.5～5.5μl；进一步优选地，进样量为：5μl。

9.优选流速为：1～1.2ml/min；进一步优选地，流速为：1ml/min；

10.优选梯度洗脱的洗脱程序为：

11.0min，流动相a的体积百分比为35%，流动相b的体积百分比为35%。流动相c的体积百分比为35%，流动相c的体积百分比为30%；

12.4～20min，流动相a体积百分比为38%，流动相b体积百分比为38%，流动相c体积百分比为24%；

13.21～41min，流动相a体积百分比为45%，流动相b体积百分比为45%，流动相c体积百分比为10%；

14.41.01～46min，流动相a的体积百分比为35%，流动相b的体积百分比为35%，流动相c的体积百分比为30%。

15. 优选地，流动相c的浓度为4-6mmol/l；进一步优选地，流动相c的浓度为5mmol/l。

16. 优选地，流动相的ph值为6-7；进一步优选地，流动相的ph值为6.5-7；进一步优选地，流动相的pH值为6.5。

17.优选c18色谱柱的直径为4-5mm，长度为200-300mm，填料粒径为4-6μm。

18.优选c18色谱柱为：titank c18(250

×

4.6mm, 5μm ) 或 zorbax eclispse plus c18 (250

×

4.6mm, 5μm)。

19. 优选地，c18色谱柱的柱温为：24-36℃；进一步优选地，c18色谱柱的柱温为：25-30℃；更进一步优选地，c18色谱柱的柱温为：30℃。

20.优选地，所述化妆品或化妆品原料的待测液体包括样品溶液；样品溶液由化妆品或化妆品原料样品与萃取溶剂混合萃取而成。萃取溶剂为甲醇、乙腈、异丙醇和四氢呋喃中的至少一种。

21. 优选地色谱纯乙腈密度，混合提取采用涡旋混合和超声波提取的方式进行。

22. 优选地，涡流混合时间为24-36s；进一步优选地，涡流混合时间为25-30s。

23. 优选地，超声波提取时间为12-18分钟；进一步优选地，超声波提取时间为15-18分钟。

24.优选地，检测前对样品溶液进行过滤。

25.优选地，过滤采用0.30～0.65μm膜过滤；进一步优选地色谱纯乙腈密度，过滤采用0.45μm滤膜。

26.优选地，萃取溶剂为乙腈和四氢呋喃的混合溶液，混合溶液中乙腈和四氢呋喃的体积比为(3～5):1 进一步优选地，萃取溶剂为乙腈和四氢呋喃的混合溶液，混合溶液中乙腈和四氢呋喃的体积比为(3.5～4.5):1；进一步优选，萃取溶剂为乙腈和四氢呋喃的混合溶液，混合溶液中乙腈和四氢呋喃的体积比为4:1。

27.优选地，色谱的检测器为pda检测器，检测波长为：325nm。

28.优选地，待测液体还包括标准工作液。

29. 优选地，标准工作溶液的制备方法如下：将标准品用甲醇配制成质量浓度为1000mg/l的标准储备液，然后稀释成三份或三份。更多不同质量浓度的标准工作溶液。进一步优选地，标准工作液的制备方法如下：将标准品用甲醇配制成质量浓度为1000mg/l的标准储备液，然后稀释成5种以上不同质量浓度的标准工作液。 进一步优选地，标准工作溶液的制备方法如下：将标准品用甲醇配制成质量浓度为1000mg/l的标准储备液，然后稀释至5mg/l、5mg/l、10mg/l 、20mg/l、50mg/l、100mg/l，共6种不同质量浓度的标准工作溶液。标准物质有视黄酸、异维甲酸、羟基频哪醇视黄酸酯、视黄酸醛标准品、乙酸视黄酯、棕榈酸视黄酯、视黄醇、丙酸视黄酯、视黄酸视黄酯。

30.@ >本发明的有益效果是：本发明的检测方法首次确立了化妆品或其原料中的视黄酸、异维甲酸、视黄醇、视黄醛、视黄醇乙酸高效液相色谱检测酯类、羟基频哪醇视黄酸酯、视黄醇丙酸酯、视黄醇视黄酸酯、视黄醇棕榈酸酯等9种视黄醇的高效液相色谱检测方法，检测范围涵盖7种视黄醇（视黄醇、视黄醛、视黄醇醋酸酯、羟频哪醇视黄酸酯、视黄醇）化妆品目录中的丙酸、视黄醇）及其原料视黄酸、棕榈酸视黄酯）及其两种降解产物（视黄酸、异维甲酸），检测方法准确，稳定性高。

31. 本发明的检测方法在检测9种视黄醇相关成分时，在0.5-100mg/l范围内具有良好的线性，相关系数大于< @0.99，检测浓度为[email protected]/kg(s/n=3)。空白基质加标回收率为85.3%- 116.1%，相对标准偏差0.7%-9.8%，可为视黄醇原料降解监测、原料稳定性研究和风险评估提供技术支持.

图纸说明

32.图1为9种视黄醇混合标准工作液的液相色谱图；

33.图。图2为9种视黄醇在异丙醇体系中的液相色谱图；

34.图。图3是9种视黄醇四氢呋喃体系中物质的液相色谱图；

35.图。图4为9种视黄醇在不同pH条件下的液相色谱图；

36.图。图5为9种视黄醇在不同柱温条件下的液相色谱图；

37.图。图 6 为 9 种类维生素 A 加标酒精样品的液相色谱图。

具体实施例

38.下面结合附图和实施例对本发明的具体实施作进一步的详细说明，但本发明的实施和保护不限于此。需要指出的是，以下过程如果没有具体详细描述，本领域技术人员可以参照现有技术实现或理解。如果使用的试剂或仪器未注明生产厂家，则视为常规产品，可在市场上购买。

39.示例1

40.仪器和试剂

41.使用的仪器有：配备g1329b自动进样器的Agilent 1260infinity高效液相色谱仪、g1316a柱温箱、g1315c二极管阵列检测器； elma s300h 超声波清洗机； ikalabdancer 涡流混合器； Millipore Milli q参考超纯水发生器，Mettler msdu电子天平（1/100000).

42.所用试剂为：维甲酸（99.90%，中国医药生物制品检测所）；异维甲酸（99.80%，中国药品生物制品检定所）；羟基频哪酮视黄酸酯（99.00%，麦克莱恩）；视网膜（98.17%，阿拉丁）；乙酸视黄酯（98.80%，纯）；视黄醇棕榈酸酯（97.60% ，纯的）；视黄醇（99.30%，坛墨质检）；视黄醇丙酸酯（90.00%，trc）；视黄醇视黄酸酯（98.46%，麦克莱恩）；醋酸铵（分析级）；乙腈、四氢呋喃（均为色谱级）；实验用水为一级纯净水。

43.@ >本例中化妆品或其原料中添加剂的检测方法包括以下步骤：

44.(0.1@>标准工作溶液的制备

4 5.称取9种视黄醇（视黄酸、异维甲酸、羟基频哪酮视黄酸酯、视黄醛、视黄醇乙酸酯、视黄醇棕榈酸）酯、视黄醇、视黄醇丙酸酯、视黄醇视黄酸酯的标准物质各10mg )于10ml容量瓶中，用甲醇溶解定容（其中：棕榈酸视黄酯、丙酸视黄酯和视黄酸视黄酯需加入适量异丙醇溶解标准品，再加入甲醇定容），配制成质量体积为 1000mg/l 的标准储备溶液。取适量标准储备液，用甲醇稀释成5mg/l、10mg/l、20mg/l、50mg/l、100mg/l共5种质量浓度。 4℃避光保存不同质量浓度的标准工作溶液。

46.(0.5@>样品预处理

47.取1g糊状样品（精确到0.001g）置于10ml带塞比色管中，加入乙腈：四氢呋喃（体积比80：20)至标记，涡旋30s，使样品与萃取溶剂充分混合，超声萃取15 min，室温放置，用0.45 μm滤膜过滤，滤液作为溶液乳状样品和奶油状样品前处理步骤与奶油状样品相同，水样可直接用甲醇萃取。

48.(3)经高效液相色谱仪检测

49.色谱测试条件为：色谱柱：c18，250mm*4.6mm，5μm；柱温：30℃；进样量：5μl；流速：1.0ml/min；检测波长：325nm；流动相a：乙腈；流动相b：四氢呋喃；流动相c：5mmol/l乙酸铵溶液，洗脱方式为梯度洗脱，具体洗脱程序见表1：

50.表1梯度洗脱程序

51.时间 (min) 流动相 a (%) 流动相 b (%) 流动相 c (%) 8242451.53530

52.按上述梯度洗脱程序进行洗脱，得到9种视黄醇混合标准工作溶液的液相色谱图，如图1所示。从图1可以看出色谱峰a1为视黄醇酸(5.240min)；色谱峰a2为异维甲酸（5.981min）；色谱峰a7为视黄醇（8.145min）；色谱峰a5为醋酸视黄醇(14.425min)；色谱峰a4为视黄醛（15.105min）；色谱峰a3为羟基频哪醇视黄酸酯(16.209min))；色谱峰a8为丙酸视黄酯(17.659min)；色谱峰a9为视黄醇视黄酸酯(32.545min)；色谱峰a6为视黄醇棕榈酸酯（35.452min）。

53.检测条件优化：

54.1、色谱条件选择色谱柱

55.列选择：

56.c18色谱柱适用于非极性、弱极性和中等极性化合物，适用于分析分子量较小的化合物。因此，本发明选用常规的c18色谱柱进行分离，对titank c18(250

×

4. 6mm, 5μm, Philomon) 和 zorbax eclispse plus c18 (250

×

4.6mm，5μm，安捷伦）两种品牌的c18色谱柱，结果表明在相同色谱条件下，9种视黄醇对两种c18均能获得良好的分离效果和色谱峰形色谱柱，均能满足系统适应性要求。在本发明实施例中，选择zorbax eclispse加c18作为分析柱。

57.流动相选择：

5 8.反相高效色谱中，以水为流动相，以甲醇、乙腈、四氢呋喃、异丙醇为改性剂

。其中乙腈洗脱能力强，粘度低。相同条件下，柱背压低于甲醇，短波长处的吸收和干扰低于甲醇。因此，本发明采用乙腈作为三元流动相的组分之一。

59.乙腈-异丙醇-水、乙腈-四氢呋喃-水、乙腈-异丙醇-乙酸铵、乙腈-四氢呋喃-乙酸铵、乙腈-包括四氢呋喃-在内的7种流动相体系的效果-甲酸铵、乙腈-四氢呋喃-磷酸二氢钾、乙腈-四氢呋喃-磷酸二氢钠，对9种视黄醇的色谱行为，具体结果如图2和图3所示，图2为液相色谱图9种视黄醇在异丙醇体系中的分析，其中，图2(a)为9种视黄醇在乙腈-异丙醇-水体系中的液相色谱图；图2(b)是9种视黄醇在乙腈-异丙醇-醋酸铵体系中的液相色谱图。从图2(a)和图2(b)可以看出，在异丙醇体系中，视黄醛、乙酸视黄酯和视黄酸羟基频哪醇不能有效分离，色谱峰形较差。 [0020] 图3是9种视黄醇在四氢呋喃体系中的液相色谱图；其中，图3(a)为9种视黄醇在乙腈-四氢呋喃-水体系中的液相色谱图；图3(b)为9种视黄醇在乙腈-四氢呋喃-乙酸铵体系中的液相色谱图；图3(c)为乙腈-四氢呋喃-磷酸二氢钠体系中的9种视黄醇。 图3(d)为乙腈-四氢呋喃-磷酸二氢钾体系中的9种视黄醇的液相色谱图；图3(e)为9种视黄醇在乙腈-四氢呋喃-甲酸铵体系中的液相色谱图。从图3可以看出，在四氢呋喃体系中，当磷酸二氢钾或磷酸二氢钠为缓冲溶液时，维甲酸和异硫甲酸不能有效分离。当醋酸铵作为缓冲溶液时，各组分的分离效果和峰形均优于甲酸铵和水。最后选择乙腈-四氢呋喃-乙酸铵作为流动相体系，采用梯度洗脱程序进行洗脱。

60.缓冲液pH值的选择：

61.在反相高效液相色谱中，调节流动相的pH值，可以抑制化合物的解离，减少拖尾，改善峰形，提高分离的选择性。本发明检测缓冲溶液的pH值4.5、5.5、6.5、7.5和8.5，对各组分色谱行为的影响，具体结果见图4，其中： 图4(a)为9种视黄醇在pH4.5条件下的液相色谱图；图4(b)为9种视黄醇在pH5.5条件下的液相色谱图；图4(c)为9种视黄醇在pH5.5条件下@6.5的液相色谱图；图4(d)为9种视黄醇在pH7.5条件下的液相色谱图；图 4(e) 是 9 种不同视黄醇在 pH 8.5 下的液相色谱图。从图4可以看出，当pH值为4.5时，维甲酸、异维甲酸和视黄醇三种物质不能有效分离。在其他 pH 条件下，9 种视黄醇之间没有显着差异。综合考虑色谱柱的适用条件、视黄醇的性质和缓冲盐的pka值，最终选择缓冲溶液的pH值为6.5。

62.柱温的选择：

63.一般来说，在色谱分析过程中，柱温会影响流动相的温度。化合物和固定相的结合和分离。在色谱柱允许范围内，随着柱温的升高，柱填料的活性会增加，化合物的洗脱能力会增强，化合物的保留时间会缩短。因此，本发明考察了不同柱温（25℃、30℃、35℃、40℃）对9种视黄醇色谱行为的影响，具体结果如图5所示，其中图5(a))为9种视黄醇在柱温25℃条件下的液相色谱图；图5(b)为9种视黄醇在柱温30℃条件下的液相色谱图；图5(c)为9种视黄醇在柱温35℃条件下的液相色谱图；图5(d)为9种视黄醇在柱温40℃条件下的液相色谱图。从图5可以看出，在25°C、35°C和40°C时，维甲酸和异维甲酸的相对保留时间均比30°C时前移；其他七种组分的相对保留时间都随着柱温的升高而增加。因此，本发明最终选择柱温为30℃。

64.2、样品提取液的选择

65.本发明选取奶油和水样，分别进行考察。甲醇、乙腈、甲醇：四氢呋喃（80:20)、丙酮

腈：四氢呋喃（80:20)四种萃取溶剂的萃取效果。测试结果表明：奶油样品在甲醇或乙腈中萃取效果较差；在乙腈中：四氢呋喃（80:20))，分散效果好，提取效果好。水性样品在以上四种提取溶剂中均能很好地提取效果。

66.3、线性方程、方法检出限和定量限

67.选择9种视黄醇类物质（视黄酸、异视黄酸、羟基频哪酮视黄酸酯、视黄醛、乙酸视黄酯、棕榈酸视黄酯、视黄醇、丙酸视黄酯、视黄醇黄酮醇视黄酸不同浓度梯度的标准工作溶液酸酯），具体浓度梯度为：0.5mg/l, 5mg/l, 10mg/l, 20mg/l, 50mg/l, 100mg/l, 试验根据试验条件在本发明实施例中，质量浓度由峰面积线性回归，检出限(lod)按3倍信噪比(s/n)计算，检出限(lod)为通过 3 倍的信噪比 (s/n) 计算得出。 /n) 计算定量限 (loq)。该方法对9种视黄醇的检出限为0.4mg/kg，定量的方法限为1mg/kg，定量限为1mg/kg，在0.5mg/l～内线性范围为100mg/l，相关系数大于0.99，说明9种视黄醇具有良好的线性关系。 9种视黄醇的线性回归方程、相关系数及方法检测浓度见表2。

68.表2 9种视黄醇的线性回归方程、相关系数及方法检测浓度

[0069][0070][0071]

4、方法精度和回收率

[0072]

选择面霜和水 对常见化妆品配方的阴性样品进行了回收率和精密度测试。添加浓度分别为500mg/kg和100mg/kg。对样品进行预处理，每种基质类型平行制备6份，按照实施例中的测试条件进行测试。并记录色谱图，计算9种视黄醇的回收率和精密度，具体测试结果见图6和表3，结果表明精密度结果为0.1%～1. 4%；该方法的回收率为85.3%～116.1%，相对标准偏差为0.7%～9.8%，可满足所需的检测要求。

[0073]

表3回收率和精密度测定结果

[0074][0075]

6、稳定性测试：

[0076]

选择高低2两个质量浓度水平（5mg/l和100mg/l）的标准工作溶液分别在0、8、12、18、@根据本发明实施例的测试条件，在>24、48h时测定9种视黄醇的色谱峰面积。其中，24h内的rsd作为日内稳定性，48h内的rsd作为日内稳定性。测试结果见表6。

[0077]

表6标准工作液稳定性测试结果

[0078][0079]

从上表6可以看出：9种视黄醇在48h内均稳定，进一步说明本发明的检测方法具有较高的稳定性和重复性。

[0080]

以上对本发明的实施例进行了详细说明，但本发明不限于上述实施例，在本领域普通技术人员所拥有的知识范围内，还可以进行各种改动而不作任何改动。背离本发明的精神。并且，本发明实施例及实施例中的特征可以相互组合而不冲突。