绿色荧光融合蛋白表达载体的制备方法和方法研究

激光共焦显微镜样品制备方法

随着生物学研究的深入，越来越多的研究需要在体内细胞甚至动物水平上研究蛋白质的功能或动态变化。随着检测设备的改进、各种显微技术的发展和标记方法的改进，如激光共聚焦显微镜在生物学研究中的广泛应用，研究人员可以快速、准确地观察蛋白质在细胞内的表达。表达情况和位置。通过激光共聚焦显微镜观察荧光标记细胞中的蛋白质和分子，为生物学研究提供了一种更直观的观察手段。因此，免疫荧光样品的制备也成为生物学研究的基本技术方法。鉴于生物体内的复杂多样性，制备免疫荧光样品的方法也存在一些差异。本文主要介绍绿色荧光融合蛋白表达载体的构建，以及绿色荧光融合蛋白和免疫荧光样品在培养细胞中的制备。

1 绿色荧光融合蛋白表达载体的构建

绿色荧光蛋白（GFP）及其突变体可在多种生物系统中表达，对细胞生物学研究具有重要意义。荧光蛋白的折叠能力及其与细胞内蛋白的融合能力使研究人员能够直接观察细胞内蛋白质的特性。研究人员不需要对蛋白质进行纯化、标记然后将其转移到细胞中，可以直接在细胞水平甚至整个动物体水平进行观察。当研究人员没有合适的抗体来识别目标蛋白时，在细胞中表达绿色荧光融合蛋白可视为一种快速且合适的研究方法。

使用标准分子生物学技术构建荧光蛋白。目的蛋白的 cDNA 通过 PCR 扩增，插入荧光蛋白表达载体的多克隆位点。载体的构建方法和过程请参考《分子克隆实验指南（第三版）》。在设计荧光融合蛋白之前，研究人员应该考虑荧光融合蛋白的用途，使用哪种荧光蛋白，以及荧光蛋白插入的位置（N端、C端或定位信号序列之后）。

2 荧光表达载体的介绍

将构建的荧光表达载体大量扩增，通过质粒提取试剂盒纯化磷酸钙共沉淀转染的方法，得到不含内毒素的纯化质粒。将表达载体导入培养细胞后，培养后即可检测荧光蛋白。将基因导入哺乳动物培养细胞的方法有很多，而生化转染是一种非常常用的将基因导入培养细胞的方法。常用的转染方法包括磷酸钙转染和脂质体介导的转染。这些方法都通过与化学试剂（磷酸钙或脂质体）形成 DNA 复合物来促进 DNA 进入细胞。根据细胞类型，使用不同的转染策略。

2. 1 玻璃板的搬运

免疫荧光样品通常在载玻片上制备，以便在共聚焦显微镜上观察。培养的细胞需要在盖玻片上粘附生长。盖玻片的厚度应小于 0. 17 mm。购买的盖玻片需要在玻璃清洗液中浸泡一天以上，然后用去离子水冲洗干净，去除剩余的清洗液。盖玻片经过高压灭菌并放置在细胞培养皿中以培养细胞。对于贴壁不良的细胞（如293T），或与细胞外基质相关的研究，玻片应预先涂有细胞外基质，如poly-L-Lysine、Fibronectin、Laminin等。

2. 2 细胞培养和转染

根据标准培养方法培养哺乳动物细胞。细胞转染前一天，将培养的细胞以 1:4 的比例接种于含有载玻片的细胞培养皿中。第二天，细胞将增长到 50% 的密度。细胞转染后，继续培养1～2天，使GFP-tagged蛋白的表达水平达到荧光显微镜可检测的水平或实验所需时间。

3 免疫荧光染色

用预冷的 PBS 缓冲液洗涤细胞以去除残留的培养基。立即添加 4% 多聚甲醛 (PFA) 固定剂。在室温下固定 15 分钟。用PBS清洗残留的固定液后，用0. 5% Triton X-100处理细胞5分钟，可以穿透细胞膜，让抗体等大分子穿过细胞膜进入细胞内部的固定细胞。但这样做会损坏细胞膜。

用PBS洗涤透化溶液。将细胞在含有 1% BSA 的 PBS 中孵育，并在室温下封闭 30 分钟。其目的是阻断细胞和载玻片并减少抗体的非特异性吸附，从而降低背景。如果只使用荧光标记的小分子或化合物，则可以省略此步骤。一抗结合。将抗体稀释到含有 1% BSA 的 PBS 中，并在 4°C 下孵育细胞 1 小时或过夜。所用抗体浓度一般为0.1~10μg/mL。由于不同的抗体具有不同的亲和力和识别能力，应根据抗体的性质进行调整。用 PBS 中的 1% BSA 洗涤细胞 3 次，每次 5 分钟，以去除多余的抗体。然后使用荧光标记的二抗或染料，用含 1% BSA 的 PBS 溶液稀释，室温孵育 1 h。整个过程需要小心避免强光，防止荧光团猝灭。然后用 PBS 洗涤载玻片以去除残留的荧光染料或抗体。*最后去除载玻片上多余的 PBS，并用安装介质安装载玻片。封固剂固化后，可在激光共聚焦显微镜下观察。

4 建议

4. 1 荧光表达载体的选择与构建

当对目标蛋白的功能或定位知之甚少时，可以尝试将荧光蛋白定位在目标蛋白的N端或C端。但当靶蛋白上有定位信号或末端被修饰时，需要将荧光蛋白插入靶蛋白的所需位置，以免荧光蛋白的插入对靶蛋白的影响。蛋白质功能或定位。

由于绿色荧光蛋白的缺陷，衍生出许多GFP的突变体，使荧光蛋白变得丰富多彩。因此，在设计荧光融合蛋白之前，需要考虑：是否有合适的设备来检测荧光信号？你会使用几种不同的荧光蛋白吗？荧光融合蛋白够亮吗？大多数表达荧光蛋白的克隆载体已经商业化。其中，应用最广泛的商业荧光蛋白表达克隆载体是pEGFP-C1或pEGFP-N1系列（BD Biosciences Clontech）。

4. 2 细胞培养和转染

上述生化介导的质粒转染方法是瞬时引入。这种方法允许细胞暂时但高水平地表达感兴趣的蛋白质。一般在转染后1～4天内即可获得大量表达蛋白。还有物理方法（电穿孔和显微注射）和病毒介导的方法。当常规方法难以转染细胞（如原代细胞）磷酸钙共沉淀转染的方法，或转染试剂毒性较大时，可采用显微注射将表达载体导入细胞核。该方法适用于需要严格控制蛋白质表达水平的实验。

对于活细胞实验，需要实验设备来维持细胞生长。显微镜需要配备合适的热台，可以控制一定的CO2浓度，合适的湿度和温度等。另外，它是倒置显微镜吗？可以用高倍率、油或水显微镜观察细胞吗？为了便于成像，一般使用底部有载玻片的细胞培养皿。由于显微镜不是无菌环境，一般活细胞实验无法保证观察过程中的无菌性，观察后细胞通常会被丢弃。

4. 3 细胞固定和染色

除了上述用多聚甲醛固定细胞的方法外，还有一种常用的方法：将培养的细胞在-20℃预冷的甲醇中孵育5分钟。但是，不建议将此方法用于固定表达荧光蛋白的细胞和 FRET 实验。原因如下：这种处理会沉淀细胞内蛋白质，而不是使它们交联。此外，为了尽量减少抗体的量，可以将载玻片放在一层封口膜上，然后将抗体溶液加入载玻片中。这是利用Parafilm的疏水性将抗体溶液浓缩在载玻片上，可以充分利用抗体溶液，节省抗体。

由于大多数实验需要同时观察两种或多种细胞内成分，因此需要对细胞进行多重荧光标记。这时，研究人员需要综合考虑实验的目的、使用的共聚焦显微镜的配置以及现有的实验材料。通常，共聚焦激光显微镜配备 4 个激光器（405 nm 半导体固态激光器、氩离子激光器、543 nm 氦/氖激光器或 561 nm 半导体固态激光器和 633 nm 氦/氖激光器）。405nm激光可观察DAPI、Hoechst和Alexa-405系列染料；氩离子激光可观察GFP、CFP、YFP等荧光蛋白和Alexa-488、FITC等染料；543 nm 和 561 nm 激光可以观察荧光蛋白如 RFP 和染料如 Alexa-546、 Alexa-561、Cy3、TRITC 和罗丹明；633nm激光可以观察Alexa-647和Cy5等染料。当研究人员需要使用上述染料进行多重标记时，需要考虑各种抗体的来源，需要使用不同物种的抗体进行染色。例如，可以使用以下组合进行细胞标记：DAPI 标记细胞核，GFP 融合蛋白标记感兴趣的蛋白质，Alexa-561 标记的抗小鼠抗体和 Alexa-633 标记的抗兔抗体。除了用抗体标记细胞外，荧光染料标记的化合物也可以用来标记细胞中的一些细胞结构和细胞器，如鬼笔环肽标记F-肌动蛋白；ER-tracker 标记内质网；Mito-tracker 标记线粒体；Lyso-tracker 标记溶酶体等，

综上所述，由于生物体中蛋白质的多样性，在制备免疫荧光样品的过程中，应根据蛋白质和不同蛋白质的具体特性选择合适的方法，从而准确地了解细胞内蛋白质的功能和动态变化。观测到的。

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