安徽农业大学：茶氨酸含量与茶品质呈高度正相关

颁发单位：安徽农业大学

应用生物技术：TMT 蛋白质组学、泛素化蛋白质组学

（部分数据分析由鹿鸣生物提供技术支持）

● 研究背景

茶树 (Camellia sinensis L.) 因其独特的风味和健康益处而成为世界上最受欢迎的饮料作物之一。茶叶中丰富的次生代谢物，如黄酮类、茶氨酸和咖啡因，赋予了泡茶的质量和健康益处。茶氨酸是茶树中特有的一种非蛋白质氨基酸，一般占茶叶干重的1-2%，茶叶中的游离氨基酸高达40-70%。茶氨酸含量与茶叶品质呈高度正相关。大量研究表明，茶氨酸具有许多健康作用，包括降低焦虑、降低血压、控制高血压和抑制肿瘤生长。

在本文之前的一项研究中，作者探索了茶树中不同水平和形式的氮对氨基酸代谢的转录调控[1]。目前尚不清楚氮如何在茶树根部的蛋白质水平上调节茶氨酸和黄酮类化合物的代谢。泛素化是一种重要的翻译后修饰，主要通过靶向降解蛋白质来调节植物的生长、发育和胁迫适应。最近的研究结果表明，泛素化参与植物对氨基酸和类黄酮代谢的适应 [2,3]。然而，泛素化如何参与茶树根部的氨基酸和类黄酮代谢仍有待发现。

●研究技术路线

● 研究成果

1. 缺氮减少茶氨酸积累，增加茶根中类黄酮的积累

选择相似大小的水培茶苗进行缺氮（0 N）和正常氮处理（CK）。处理后10天收集发育良好的根进行进一步分析（图2a）。为了验证缺氮处理对茶树幼苗的影响，作者首先检测了以往研究中鉴定的缺氮反应基因的表达，包括CsNRT1.2、CsNRT1.5、 CsAMT3.1和CsLBD38，结果表明，与CK相比蛋白质水平，CsNRT1.2和CsAMT3.1显着上调，CsNRT1.5和CsLBD38 显着下调（图2b）。此外，在 0 N 处理下也观察到根系发育增加。这些结果表明氮缺乏治疗是有效的。

作者接下来测量了根中 EA、游离氨基酸和类黄酮的含量。这些游离氨基酸的含量在缺氮条件下持续存在并显着降低（表1））。值得注意的是蛋白质水平，在茶氨酸合成途径中，Thea、Glu 和 Gln 在 0 N 下显着降低（图 2c）。西阿生物合成的另一种前体 EA 的含量也显着下降。相反，黄酮类化合物的积累在 0 N 时增加（图 2df）。这些结果表明，N缺乏抑制了茶根中的茶氨酸代谢并抑制了促进黄酮类化合物的代谢。

表 1 | 缺氮时游离氨基酸含量

图 2 | 缺氮对茶树根系生长发育的影响

2.黄酮类和氨基酸代谢途径是根系缺氮的核心反应

为了探索氮如何调节茶树根中的茶氨酸和类黄酮代谢，我们在 CK 和 0 N 条件下对根进行了 TMT 蛋白质组学分析。结果，共鉴定出 6612 种蛋白质。与之前的转录组数据相比，97.6% 的蛋白质包含在转录组数据中（图 3a）。统计分析发现 545 种差异蛋白（DEP），包括 239 种上调蛋白和 306 种下调蛋白（图 3b）。KEGG分析表明，上调的蛋白质在“次级代谢物生物合成”、“苯丙烷生物合成”、“类黄酮生物合成”和“苯丙氨酸代谢”中显着富集（图3c）。下调的蛋白质富含“核糖体”、“苯丙烷生物合成”、“ 光合生物中的碳固定”和“光合作用”（图 3d）。这些结果表明，氮缺乏显着改变了茶树根部苯丙烷和类黄酮代谢途径中的蛋白质水平。

然后，作者将这些 DEP 与先前研究中鉴定的差异表达基因 (DEG) 进行了比较（图 3e），结果表明，超过一半的 DEP 在转录水平上对 0 N 没有显着反应。这表明茶根中存在响应于ON的转录后或翻译后调节。KEGG分析显示，100个共上调基因在苯丙烷和类黄酮代谢中显着富集，150个共下调基因在氮、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢中显着富集（图3f-g）。为了验证这些结果，通过 qRT-PCR 检测了编码 CsGS、CsAlaDC、CsGDH2、CsPALs、CsCHS1、CsDFR、CsFLS 和 CsANS 的九个基因的表达。qRT-PCR结果与转录组数据高度一致，

图 3 | 差异表达蛋白 (DEP) 和差异表达基因 (DEG) 的比较分析

3.茶树根中泛素化蛋白的鉴定

泛素化是一种经典的翻译后修饰，主要通过靶向降解蛋白质来调节植物的生长和发育。为了进一步探索根中氮调节的茶氨酸和类黄酮生物合成，作者通过泛素化蛋白质组学分析鉴定了茶树根部中的泛素化蛋白质。结果共鉴定出2264个蛋白质上的4869个赖氨酸泛素化（Kub）位点。为了了解 Kub 位点周围氨基酸的身份，使用 iceLogo 分析了赖氨酸残基泛素化的频率。结果，观察到对泛素化 Lys 附近的亲水残基的偏好，包括 Asp(D)、Glu(E) 和 Arg(R)（图 4c）。在 4789 个 Kub 肽中，鉴定了 16 个保守基序（图 4a）。16 个 Kub 基序表现出不同的丰度，其中 ..EK.. 主题是最广泛分布的（图4b）。为了深入了解泛素化蛋白质的功能，进行了 KEGG 富集分析。泛素化蛋白质在谷胱甘肽代谢、内吞作用、糖酵解、泛素介导的蛋白水解、萜类醌生物合成、磷酸戊糖途径和苯丙氨酸代谢中显着富集（图 4d）。）。亚细胞定位结果显示泛素化蛋白主要分布在细胞核、细胞质、质体和质膜中（图4e）。萜类醌生物合成、磷酸戊糖途径和苯丙氨酸代谢（图 4d）。）。亚细胞定位结果显示泛素化蛋白主要分布在细胞核、细胞质、质体和质膜中（图4e）。萜类醌生物合成、磷酸戊糖途径和苯丙氨酸代谢（图 4d）。）。亚细胞定位结果显示泛素化蛋白主要分布在细胞核、细胞质、质体和质膜中（图4e）。

图 4 | 茶树根中泛素化蛋白的序列表征

4. 整合转录组学、蛋白质组学和泛素化蛋白质组学分析确定了对蛋白质氮缺乏的不同反应模式

为了进一步阐明多层次黄酮类和茶氨酸代谢的调节，我们对转录组、蛋白质组和泛素组数据进行了综合分析。如图5a所示，在2264个泛素化蛋白质中，1601个与蛋白质组鉴定结果重叠，2231个蛋白质与转录组鉴定基因重叠。在三个数据集中共鉴定了 1585 个基因/蛋白质。然后，作者将泛素化蛋白与上调和下调的 DEP 和 DEG 进行了比较。这些比较确定了对 ON 的不同反应模式，如图 5B 和 C 所示。例如，55 种蛋白质在 mRNA 和蛋白质水平上均被上调，并且也被泛素化（图 5b），30 种蛋白质被下调在mRNA和蛋白质水平上，并且也被泛素化（图5c）。

代谢物的积累是许多过程组合的结果，包括生物合成、运输和降解。这些过程通常受激素介导的信号传导、表观遗传修饰介导的转录和转录后调控以及翻译后修饰的调控。因此，作者接下来试图鉴定参与氨基酸和类黄酮代谢、转运、激素调控、转录调控、表观遗传调控和泛素介导调控的蛋白质。发现除了许多结构基因和转运蛋白外，MYB和LBD转录因子、组蛋白、组蛋白脱乙酰酶、DNA甲基转移酶、E2泛素连接酶和E3泛素蛋白连接酶也对ON有反应，其中一些也是泛素化的蛋白，

图 5 | DEG、DEP 和泛素化蛋白的比较分析

5.蛋白质水平调节茶氨酸代谢以应对根系缺氮

为了探索茶根中茶氨酸代谢的蛋白质水平调节，我们分析了茶氨酸生物合成、氮吸收和氮同化途径中的 DEG 和泛素化蛋白。Glu和EA是茶氨酸生物合成的前体。作者发现 Glu 和 Thea 生物合成中的蛋白质通常在 0 N 时下调（图。6）。丙氨酸（Ala）是由丙氨酸氨基转移酶（CsAlaT）从丙酮酸合成的，然后是丙氨酸脱羧酶（CsAlaDC）是代谢为 EA（图 6））。CsAlaT 和 CsAlaDC 在 mRNA (CsAlaT) 或蛋白质 (CsAlaDC) 水平上均下调，并且在 0 N 时均被泛素化。这些结果表明 CsAlaT 和 CsAlaDC 是衍生自丙酮酸合成 EA 在茶氨酸生物合成中起着重要的调节作用（图 6）.

Glu不仅是茶氨酸生物合成的前体，也是氮代谢最重要的初级代谢产物之一。因此，Glu合成受到严格控制。Glu可以通过GS/GOGAT循环或茶树中的谷氨酸脱氢酶（GDH）合成。值得注意的是，一个 CsGS、两个 CsGOGAT 和一个 CsGDH 在蛋白质水平上被下调，并且 CsGS 在 0 N 中也被泛素化（图 6）。有趣的是，茶氨酸合酶 (CsTSI)，一种从 Glu 合成茶氨酸的酶和 EA，在 RNA 或蛋白质水平上没有显着变化，但它可能被泛素化。因此，泛素化可能在调节 CsTSI 活性中发挥作用。

图 6 | 参与茶氨酸和谷氨酸代谢的 DEG 和 DEP

6. 苯丙烷和类黄酮代谢对根系缺氮反应的蛋白质水平调控

但在蛋白质水平显着增加并被泛素化。此外，黄酮醇合酶 (CsFLS)、二氢黄酮醇还原酶 (CsDFR)、花青素合酶 (CsANS) 和花青素还原酶 (CsANR) 在蛋白质水平上显着增加和泛素化。这些结果表明，这些蛋白质的稳定性在缺氮条件下增加，然后促进类黄酮代谢物的合成。

图 7 | DEGs 和 DEPs 参与苯丙烷和类黄酮代谢

● 研究结论

本研究揭示了茶根中氮对茶氨酸和类黄酮生物合成的多层次调控（图8））。N 供给下，促进了茶氨酸的生物合成，抑制了黄酮类化合物的代谢。N缺乏与茶氨酸合成相关的结构基因在mRNA和/或蛋白质水平上下调；相比之下，类黄酮生物合成途径中的大量基因在 mRNA 和/或蛋白质水平上显着上调。在类黄酮代谢的协调中，泛素化可能参与调节结构蛋白的稳定性或活性。

图 8 | 茶根中氮调节茶氨酸 (Thea) 和原花青素 (PA) 代谢模型

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茶氨酸和黄酮类化合物是茶树根部合成的最重要和最丰富的次生代谢产物。氮促进茶氨酸并抑制茶根中类黄酮的生物合成，但其潜在机制仍不清楚。本文分析了缺氮条件下茶树根部的茶氨酸和类黄酮代谢，并结合蛋白质组学和泛素化蛋白质组学数据与转录组学数据探讨了调控机制。本文的多组学数据整合与分析思路值得借鉴。

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文末花絮｜lumingbio

上海鹿鸣生物科技有限公司多年来一直专注于生命科学和生命科技领域。是国内较早开展基于蛋白质组和代谢组的多层次组学整合实验和分析的团队。目前多组学研究有成熟的技术方法，

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